睾丸组织异体异位移植生成成熟精子的动物模型建立

目的：采用免疫缺陷小鼠作为孵化器，建立小鼠睾丸组织异体异位移植生成精子的实验模型。方法：以新生小鼠睾丸组织为供体，免疫缺陷小鼠为受体进行组织移植；采用反转录-聚合酶链反应(reverse transcriptase pol-ymerase chain reaction，RT-PCR)对移植物中睾丸特异蛋白激酶(testis-specific protein kinase 1，TESK1)mRNA 表达进行检测，并应用组织形态学分析法对生精细胞的发育作进一步的验证。结果：分子生物学及组织学观察显示，移植物组织不仅可像正常小鼠睾丸组织一样表达 TESK1 mRNA，并且富含与正常成年小鼠睾丸组织中类似的精曲小管结构以及各级生精细胞和精子。结论：移植后的生精细胞可在异体异位继续发育生长，完成整个生精过程，最终发育精曲小管及成熟精子。

睾丸组织异体异位移植研究进展

自从2002年《自然》杂志发表了第1篇用同种或异种睾丸组织移植进行的生精细胞体外发育研究以来,该技术被广泛应用于不同种类动物(包括人类)睾丸组织的体外成熟的探讨。这种采用免疫缺陷动物作为受体,同种或异种睾丸组织为供体的技术与其他生精细胞体外成熟方法相比具有环境条件较易控制、重复性较好等优点。迄今为止,在用小鼠、仓鼠、猫、兔、猪、山羊、牛和恒河猴等动物睾丸组织进行的移植研究中,未成熟生精细胞在作为受体的裸鼠体内均发育到精子阶段,并通过卵细胞胞质内单精子注射(ICSI)技术,用发育成的小鼠、兔精子分别产生了下一代。本文总结了供体组织的种类和年龄,受体的性别、完整性、免疫状况和移植部位以及移植时间对移植物发育的影响,概述了近几年来采用该技术所进行的睾丸组织移植研究发展现状,并对该技术的应用以及存在的问题进行了讨论。

新生小鼠睾丸组织异体异位移植物中精子形态及功能的研究

目的采用卵胞浆内单精子显微注射(ICSI)技术探讨新生小鼠睾丸组织异体异位移植到裸鼠体内后所生成精子的受精能力。方法将含有原始生精细胞的新生1-2 d小鼠睾丸组织异体异位移植到BALB/c-nu/nu免疫缺陷小鼠背部皮下。8周后取出移植物,通过常规染色和电镜技术对生精小管中生精细胞组成和形态进行观察;以薄层明胶水解法检测精子顶体蛋白酶活性;采用ISCI技术检测移植物中具有成熟形态精子的受精能力。结果移植物的HE染色发现,新生小鼠睾丸组织在裸鼠体内已启动并进行精子发生过程,生精小管中含有包括精子在内的所有类型生精细胞;移植物组织经处理后,可计数到具有镰刀头状的长尾精子约1×103个/mg移植物;透射电镜标本中观察到的精原细胞和精母细胞均具有正常超微结构;薄层明胶水解法检测可观察到顶体蛋白酶呈阳性反应的精子;ICSI结果显示,单纯ICSI处理组与ICSI+电激活组均有受精和卵裂现象发生。结论仅含有原始生精细胞的新生小鼠睾丸组织在异体异位移植到裸鼠体内后,可以产生形态正常并具有受精能力的精子。

异体异位发育小鼠睾丸组织中精子蛋白17的表达研究

目的采用已建立的未成熟睾丸组织移植模型,研究异体异位生长发育的小鼠睾丸组织中精子蛋白17的表达情况,以评估该移植模型在生殖医学中应用的可行性。方法以1-2天小鼠睾丸组织为供体,7-12周雄性免疫缺陷小鼠为受体进行组织移植;移植8周后收取移植物组织,采用荧光定量PCR法检测移植物中精子蛋白17的基因Spa17的表达,用免疫荧光法和western blot检测精子蛋白17的表达,并与其在正常小鼠睾丸组织的表达进行对比。结果基因检测显示,Spa17在移植物中的表达与其在8周正常小鼠睾丸组织中表达相比有下调;蛋白分析提示,SP17在8周正常小鼠睾丸组织中表达而在小鼠睾丸组织移植物中表达缺失。结论移植物中在精子的精子运动和受精功能中发挥作用的精子蛋白17的基因表达下调及蛋白表达缺失提示,异体异位睾丸组织移植在临床应用的可行性还需进一步评估。

异体异位发育睾丸组织的蛋白质组图谱构建及差异蛋白分析

目的应用蛋白质组学实验方法对在异体异位生长发育的新生小鼠睾丸组织进行差异蛋白分析,从而对睾丸组织体外移植模型用于生精细胞发育研究的可行性提供进一步的理论依据。方法以新生小鼠睾丸组织为供体,免疫缺陷小鼠为受体进行组织移植,移植8周后收集移植物组织,采用双向凝胶电泳(2-DE)分离移植物组织总蛋白,同时分离8周正常小鼠睾丸组织总蛋白作对比分析,运用Im ageM aster 2D E lite 5.0图像分析软件识别移植物组织与正常组织差异表达的蛋白质点,应用基质辅助电离解析飞行时间质谱(MALD I-TOF-MS)获取肽质量指纹图谱(PMF),检索数据库鉴定差异表达的蛋白质点。结果正常睾丸组织和移植物组织双向电泳图谱的平均蛋白质点数分别为(1 326±15)个和(1 561±20)个,3次重复实验的蛋白质点位置重复性较好。通过比较两者的双向凝胶电泳图谱,得到表达差异量较大的蛋白质点21个。选取6个仅在正常睾丸组织中有表达的蛋白质点进行质谱和生物信息学分析,鉴定出的6种蛋白质,除血红蛋白α1链(Hbα-α1)外,其他5种蛋白均为在小鼠睾丸中有较高表达的蛋白质,包括A激酶锚定蛋白结合的精子蛋白(ASP)、磷脂过氧化氢物谷胱甘肽过氧化物酶(GPX4)、精子蛋白(Sp17)、天门冬酰胺酶样蛋白(ASRGL1)和过氧化物氧化还原因子4(Prdx4)。结论在本实验中,从异体异位生长发育成熟的新生小鼠睾丸组织中检测到5种在睾丸中特异性高表达蛋白质的缺失,这些蛋白质主要在精子运动、精子顶体形成以及精子的受精等功能中发挥作用。

精原干细胞和睾丸组织的同种异体移植

背景:精原干细胞作为精子发生过程的基础和前提,其自我更新和分化途径目前仍不完全清楚。目的:观察非免疫缺陷动物新生Wistar大鼠的精原干细胞和睾丸组织移植于去势成年Wistar大鼠后的成活及生长发育情况。设计、时间及地点:组织细胞形态学水平的随机动物对照实验,于2007-04/08在广西医科大学实验动物中心外科实验室完成。材料:选用健康新生7～9d雄性Wistar大鼠为供体,受体为经过严格检疫合格的8～12周的成年雄性Wistar大鼠,体质量180～220g。方法:取新生雄性大鼠睾丸,采用两步法组合酶顺序消化制备大鼠精原干细胞悬液,以Percoll不连续密度梯度离心法初步纯化精原干细胞。取10只成年雄性大鼠,切除双侧睾丸形成去势大鼠,按随机数字表法分为2组,每组5只。精原干细胞悬液移植组将制取好的1mL精原干细胞悬液在5min内注射至受体背部皮下。睾丸组织块移植组将制备好的已剖开的睾丸组织植入受体背部皮下,每个受体移植2个睾丸4块睾丸组织。主要观察指标:移植物的生长发育情况,移植8周末移植物的组织学特点及C-kit免疫组化定性分析结果。结果:精原干细胞悬液移植后,移植物未见成活生长。睾丸组织块移植后移植物部分成活,移植8周末组织学检查可见特征性的精曲小管和细胞结构,可见精子细胞,部分生精小管退化;睾丸间质中可见淋巴细胞浸润;免疫组化鉴定可见睾丸组织内C-kit阳性细胞表达。结论:同种异体异位移植于非免疫缺陷鼠中,新生睾丸组织块可以成活并能形成精子细胞,而精原干细胞悬液移植后未见移植物生长。

大鼠胚胎卵巢异体异位移植的研究

为了解胚胎卵巢异体异位移植后的存活和生长发育情况 ,将大鼠胚胎卵巢分别移植到去势雌鼠颈部皮下或肾被膜下 ,HE染色观察。移植后第 1 0天时移植物周围有结缔组织包裹 ,内有原始卵泡 ;移植后第 2 5天开始 ,移植物内可见大量发育卵泡及黄体与间质腺 ,移植卵巢中有丰富的血管。移植后平均 2 2天阴道上皮细胞出现周期性改变。细胞化学及免疫组织化学反应显示 :移植 3 5天后卵巢的卵泡膜内层细胞 3 -β羟甾脱氢酶呈阳性反应 ,卵巢血管内皮细胞碱性磷酸酶和 ATP酶为阳性 ;雌 ,孕激素及其受体反应强度与正常对照无明显差异。放射免疫法测定血清雌激素 ,孕激素 ,卵泡刺激素 (FSH)及黄体生成素 (L H)显示 ,移植 3 5天后 ,FSH和 L H的浓度接近正常。以上结果说明胚胎卵巢能在异体异位存活。

新鲜小鼠卵巢组织自体异位移植后卵巢功能的研究

目的 :测定小鼠卵巢组织自身异位移植后动情期血清中 17β 雌二醇 (E2 )和孕酮 (P)的水平 ,称量子宫湿重。在相同条件下 ,与正常同龄小鼠和绝经模型比较 ,探索卵巢组织移植后功能的变化。方法 :将约 10周大的ICR雌性小鼠 4 3只分成 3组 :A组即空白对照组 ,11只 ,不作任何处理 ;B组即去势组 ,16只 ,去除双侧卵巢 ;C组为实验组 ,16只 ,自身卵巢摘除后剪成 3～ 4块种植于腹壁皮下。术后观察阴道涂片变化 ,在动情期断头取血 ,称量子宫湿重 ,并分析子宫内膜组织形态。再用酶联免疫法测定各组血清中E2和P的水平。结果 :B组小鼠的阴道涂片在 1周左右失去正常的周期变化 ,将超过 2周未出现典型动情期者判断为绝经。C组在失去正常周期变化后 ,通常于 8± 3d重新出现动情期。A组 10周动情期小鼠的血清E2 、P的平均水平为 5 3.72pg/ml、9.86ng/ml,子宫湿重平均为 111.0 0mg ;B组分别为 4 2 .17pg/ml、1.5 8ng/ml ,2 4 .4 2mg ;C组分别为 4 7.11pg/ml、11.6 1ng/ml,95 .2 0mg。此外 ,C组子宫湿重及子宫内膜组织形态与正常小鼠无显著差异(P >0 .0 5 )而与B小鼠有明显差异 (P <0 .0 5 )。结论 :小鼠卵巢组织的自身异位移植能够恢复卵巢分泌E2 和P的功能。

组织工程骨-软骨复合组织体内异位移植的研究

目的:本实验构建组织工程骨软骨复合组织并采用异体异位移植方式,探讨外来因素对移植物的影响,为进一步研究奠定基础。方法:制备明胶-硫酸软骨素-透明质酸及明胶-陶瓷化骨多孔复合支架,复合软骨细胞和骨髓间充质干细胞,将上述组织按照体外培养时间不同分为4组,植入裸鼠皮下,观察复合组织形成情况。结果:各实验组在观察期内裸鼠背部均无感染,复合组织表面完整薄层纤维层下可见类似透明样软骨组织,体积均出现不同程度的收缩。HE染色各实验组均可发现,在软骨层和骨层,分别可见成软骨细胞、软骨细胞、骨细胞及相应的细胞外基质,且可以观察到类似正常结构的潮线出现,交界区软骨组织出现骨化,在组织外围,出现了不同程度向纤维样组织转变的现象。结论:经过体外短时间的诱导使得细胞具有分化趋势后,早期植入体内有助于组织工程骨-软骨复合组织的形成。

人冻融卵巢组织异种异位移植血管生成的研究

目的对人冻融卵巢组织在非肥胖糖尿病/重症联合免疫缺陷(NOD/SCID)小鼠异位移植后血管重建模式的观察分析。方法收集2005至2007年在中山大学附属第一医院行卵巢切除手术的6例肿瘤患者部分外观正常的卵巢组织,人卵巢组织经慢速程序化冻融后,将其移植在雄性NOD-SCID小鼠背部皮下,在移植后第1、3、7、14、28、56和85天回收移植物。用免疫组化检测小鼠血管组织中CD34和CD31的表达,并在图像中计算微血管密度(MVD);观察小鼠背部卵巢组织移植物中人血管及小鼠新生血管随时间变化的情况,免疫组化检测其中血管内皮生长因子(VEGF)的表达,并采用Histochemical Score(HS)进行半定量评价;观察人卵巢组织中小鼠血管的重建过程,免疫组化检测其中VEGF的表达。结果抗人CD34标记的MVD在移植后逐渐下降(F=2.871,P=0.024)。抗小鼠CD31标记的MVD在移植后显著增加(F=155.710,P<0.001),移植后第1天观察到极少量新生血管形成,第3天增加明显(F=75.543,P<0.001),第14天可观察到有肌层大血管形成。移植后人卵巢组织中VEGF的表达呈先增加后下降的过程,在移植后第3天VEGF的表达增加明显(F=11.072,P=0.001),第14天后开始有所下降(F=18.564,P=0.001),各时间点之间VEGF的表达差异有统计学意义(F=45.981,P<0.05)。结论人冻融卵巢组织在雄性NOD-SCID小鼠皮下移植后可快速建立血供,第14天可观察到有肌层大血管形成,VEGF的表达在移植早期明显增加,为卵巢移植早期预防及治疗缺血再灌注损伤提供了理论基础。

同种异体骨髓间充质干细胞在比格犬体内异位构建组织工程骨

背景:选用同种异体骨髓间充质干细胞作为种子细胞成为将来组织工程领域发展的趋势。目的:分析同种异体骨髓间充质干细胞在比格犬体内异位构建组织工程骨的能力,并观察骨髓间充质干细胞在体内成骨过程中的转归。方法:应用氯甲基苯甲酰氨荧光染料(CM-Dil)标记比格犬骨髓间充质干细胞,MTT法检测标记细胞的体外增殖能力。将自体或异体骨髓间充质干细胞分别接种珊瑚、β磷酸三钙支架体外成骨诱导7d后,植入比格犬背部皮下,空白支架作为阴性对照。术后3 d及1,2,4,8,12周取材,苏木精-伊红染色观察成骨情况,应用ipp软件统计分析成骨面积。PT-PCR和ELISA法检测组织工程骨成骨过程中相关基因的表达。CM-Dil组冰冻切片荧光显微镜下示踪骨髓间充质干细胞在体内的转归。结果与结论:(1)4-8周时异体组织工程骨的成骨面积小于自体组织工程骨,但到12周后2组无明显差异;(2)4周自体组织工程骨表达骨γ羧基谷氨酸蛋白高于异体组织工程骨,提示后者先于前者进入骨矿化期;(3)ELISA检测发现自体组织工程骨的碱性磷酸酶和骨钙素表达量在4周左右高于异体组织工程骨,到12周后趋于一致;(4)通过CM-Dil标记骨髓间充质干细胞发现同种异体骨髓间充质干细胞的数量相比自体骨髓间充质干细胞有明显的减少;(5)结果说明,同种异体组织工程骨在大动物体内能够异位成骨(12周),但早期(8周前)成骨效率低于自体组织工程骨,这种差别可能与骨髓间充质干细胞同种异体移植后发生免疫反应导致细胞数量减少有关。

白藜芦醇对大鼠冻存卵巢组织自体异位移植功能影响的研究

目的:探究白藜芦醇对大鼠冻存卵巢组织自体异位移植功能的影响。方法:选取24只成熟雌性Wister大鼠,并分为空白对照组、移植组、低剂量白藜芦醇组和高剂量白藜芦醇组,每组各6只。移植组、低剂量白藜芦醇组和高剂量白藜芦醇组采用手术摘取卵巢,使用玻璃化冷冻保存2周。低剂量白藜芦醇组和高剂量白藜芦醇组卵巢组织在白藜芦醇溶液中平衡,且在大鼠冻存卵巢组织自体异位移植前、后分别腹腔注射5、10μmol/L白藜芦醇处理,移植组注射等量生理盐水。使用HE染色后光镜下观察卵泡情况,并记录各组大鼠异常卵泡数目百分比。记录各组大鼠月经恢复情况,检测各组大鼠血清内氧化应激相关物质超氧化物歧化酶(SOD)、活性氧基团(ROS)含量水平。分别于第4、8周检测各组大鼠血清激素E2及P的分泌情况。结果:相比空白对照组,移植组异常卵泡数目百分比、ROS含量水平均显著升高,SOD含量及第4、8周大鼠E2及P含量均显著降低(P<0.05);相比移植组,低剂量白藜芦醇组和高剂量白藜芦醇组异常卵泡数目百分比、月经恢复时间、ROS含量水平均显著降低,第4、8周E2、P和SOD含量均显著升高(P<0.05)。结论:白藜芦醇对大鼠冻存卵巢组织自体异位移植功能恢复有促进作用,同时可以降低大鼠氧化应激反应保护大鼠卵巢。

成年大鼠卵巢异体异位移植的实验研究

目的 :探讨大鼠卵巢组织异体异位移植后的生长发育及功能情况。方法 :将成年大鼠卵巢组织植入去势成年雌性大鼠的肾被膜下 ,观察动情周期的恢复及维持 ,通过组织学和组织化学研究移植效果和测定血清雌激素水平观察卵巢内分泌功能。结果 :移植后 13 55± 2 81d出现动情周期 ,对移植卵巢的组织学观察可见不同发育阶段的各级卵泡及间质腺 ;3- β -羟甾脱氢酶组织化学显示它们呈不同程度阳性反应 ;血清学研究显示移植卵巢具有与正常卵巢相近的分泌雌激素的能力。结论 :大鼠卵巢异体异位移植能存活。

新生大鼠卵巢异体异位移植的实验研究

目的 :探讨新生大鼠卵巢异体异位移植后的生长发育及功能。方法 :将新生大鼠的卵巢移植入去势成年雌性大鼠的肾被膜下 ,移植 5 0d后取材进行组织学及组织化学研究 ,观察移植效果 ;同时测定血清雌激素水平。结果 :受体在移植后第 16 6 0± 7 4 1d出现动情周期 ,移植物内可见不同阶段的发育卵泡和间质腺 ;3- β -羟甾脱氢酶组织化学染色显示它们呈不同程度的阳性反应 ;血清E2 水平与正常成年大鼠间无显著性差异 (P >0 0 5 )。结论 :新生大鼠卵巢异体异位移植后能继续生长发育并具有内分泌功能。

早期人胎儿睾丸组织异种异体生长发育的研究

目的采用免疫缺陷小鼠为受体的睾丸组织移植技术,探索小于3月龄的人类胎儿未成熟睾丸组织在异种异位生长发育的可行性,为睾丸移植技术用于人类生精机制研究提供更为易行的供体来源。方法将9例10～13周流产胎儿的睾丸组织分别移植到6只雄性去势免疫缺陷小鼠背部皮下,根据移植物的生长状态以及受体的健康状况于不同时间取出移植物。通过对睾丸组织移植前后的组织学观察,对人类未成熟睾丸组织在异种异位的生长发育情况进行分析。结果3个月左右的胎儿睾丸约为5～7mg,移植后取出的最大移植物重量为84.1mg。9例未成熟睾丸组织移植后观察到有6例在受体中继续生长发育,其中的生精小管直径由移植时的(44.26±3.14)μm发育成为(77.69±7.47)μm。小管中无规则分布的原始生殖细胞和原始支持细胞开始向基底膜部位迁移,其中部分原始生殖细胞已定位于基底膜处,并具有精原细胞的特征;支持细胞也由幼稚状态发育为具有丰富胞质的成熟型细胞,有序排列在精原细胞周围,形成壁龛样结构。结论将较易获得的早期流产胎儿睾丸组织移植到免疫缺陷小鼠体内后,睾丸组织可继续生长发育,因此可作为人类睾丸组织生长发育研究的供体组织。

大鼠同种异体耳廓异位移植模型的可行性探讨

目的 建立稳定的大鼠同种异体耳廓移植模型。方法 将动物分为A、B两组。每组均以 10只SD大鼠为供体 ,10只Wistar大鼠为受体进行原位及异位移植。原位移植的静脉选择颈外静脉 ,动脉选择颈外动脉 ,动脉吻合平面选择甲状腺上动脉分支处 ;异位移植选择股动静脉。然后观察大鼠及其耳廓的生存情况与组织学变化。结果 两组的耳廓生存时间为 5～ 11d ,异位移植大鼠的生存率最高 ,耳廓的生存及病理改变与原位移植无差异。结论 大鼠同种异体耳廓异位移植模型对于研究带血管的体表同种异体复合组织移植排斥反应简便易行 ,稳定可靠。

幼猪同种异体异位肾移植技术探讨

目的研究大动物活体肾移植的外科技术。方法应用氯胺胴、安定静脉麻醉,游离供体左肾动、静脉及输尿管,切取左肾,离体灌注后备用。游离受体腹主动脉、下腔静脉。将供肾动、静脉分别与受体腹主动脉、下腔静脉作端侧吻合,供体输尿管与受体膀胱吻合后单J管从腹壁引出作外引流。结果22头幼猪共完成15例次活体肾移植手术。移植肾冷缺血时间为35～70min,血管吻合时间为28～52min。手术中死亡3例,其中2例(供、受体各1例)死于麻醉过深,1例死于肺动脉血栓栓塞。出现输尿管膀胱吻合口尿瘘1例,输尿管狭窄1例。结论娴熟的外科技术和良好的人员配合是大动物活体肾移植成功的基础,是减少术后并发症的关键。

细胞注射法及组织块移植法在构建异位妊娠动物模型比较

目的：比较滋养细胞悬液注射法与绒毛组织块移植法在异位妊娠动物模型中的可行性。方法：收集新鲜宫内妊娠绒毛标本30例,其中20例培养成滋养层细胞,并将传代细胞分别植入BALB/c裸鼠腹部皮下（A组）、腹壁下（B组）、宫角（C组）;另外10例绒毛组织块分别植入裸鼠盆腔内（D组）,每组6只。观察种植后第7天、第15天肿块大小的变化;第7天,各组随机选取2只成瘤裸鼠处死,解剖、切取瘤体,形态学检测并免疫组化检测;第15天处死全部裸鼠,解剖、切取瘤体,形态学检测并免疫组化检测。结果：第7天：（1）瘤体观察：A组有2只裸鼠未见瘤体形成;B组有1只未见瘤体形成;C组全部未见瘤体形成;D组全部见瘤体,组织块瘤体与机体部分融合。（2）形态学检测：A组：皮下囊肿,包膜完整,内部可见移植的细胞;B组：皮下可见移植的细胞;C组：未见种植细胞;D组：边缘绒毛滋养细胞细胞核清晰。（3）免疫组化：A组：CK18在滋养细胞胞浆呈阳性表达,滋养细胞细胞核不清或消失;B组：CK18在滋养细胞胞浆中呈阳性表达,滋养细胞细胞核不清或消失;C组：未见种植细胞;D组：CK18在滋养细胞胞浆呈阳性表达,边缘绒毛滋养细胞细胞核清晰。第15天：（1）瘤体观察：A组：有2只分别在第8天、第10天死亡,剩余2只,未见瘤体形成;B组：有1只在第8天死亡,剩余3只,有1只未见瘤体形成,另2只瘤体较前增大;C组：剩余4只,全部未见瘤体形成;D组：剩余4只,全部见瘤体,组织块瘤体增大明显;（2）形态学检测：A组：未见移植的细胞;B组：皮下可见移植的细胞;C组：未见种植细胞;D组：边缘绒毛滋养细胞细胞核清晰;（3）免疫组化：A组：未见种植细胞;B组：CK18在滋养细胞胞浆中呈阳性表达,滋养细胞细胞核不清或消失;C组：未见种植细胞;D组：CK18在滋养细胞胞浆呈阳性表达,边缘绒毛滋养细胞细胞核清晰。结论：细胞注射法难以建立可靠、稳定的异位妊娠动物模型;组织块移植法可以建立较可靠的动物模型。