lncRNA MALAT1靶向调控miR-214在睾丸缺血再灌注损伤中的作用及其机制

目的:观察长链非编码RNA肺癌转移相关转录本1(IncRNA MALAT1)在睾丸缺血再灌注损伤(IRI)中对GC-1细胞增殖和凋亡的作用及其机制。方法:建立睾丸GC-1细胞缺氧复氧模型,qRT-PCR法检测不同复氧损伤时间点IncRNA MALAT1和微小RNA-214(miR-214)的表达变化;分别采用MTT实验、流式细胞术测定转染IncRNA MALAT1对GC-1细胞增殖和凋亡的影响;采用Western blot实验检测凋亡相关蛋白caspase-3和cytc蛋白表达;荧光素酶实验验证IncRNA MALAT1和miR-214的靶向关系,并采用qRT-PCR法检测转染IncRNA MALAT1后细胞中miR-214的表达变化。结果:IncRNA MALAT1随着复氧损伤时间的增加,其表达增高,在缺氧3 h/复氧24 h细胞上调最为明显,而miR-214的表达降低;过表达IncRNA MALAT1能显著抑制GC-1细胞增殖能力,促进细胞凋亡。沉默IncRNA MALAT1可使GC-1细胞的增殖能力增强,凋亡水平减弱;荧光素酶报告实验表明IncRNA MALAT1序列上有miR-214的结合位点。过表达IncRNA MALAT1抑制GC-1细胞miR-214表达,而沉默IncRNA MALAT1能促进miR-214表达。结论:IncRNA MALAT1可以通过靶向miR-214改变GC-1细胞的增殖和凋亡能力,从而影响睾丸IRI的发生发展。

缺血后处理对大鼠睾丸缺血再灌注损伤的影响

目的观察缺血后处理对大鼠睾丸缺血再灌注损伤的影响。方法 60只成年雄性SD大鼠随机分为对照组、缺血再灌注组和缺血后处理组,每组20只。对照组行左侧睾丸假手术。缺血再灌注组予左侧睾丸扭转720度,2h后复位。缺血后处理组予左侧睾丸扭转720度,2h后行缺血后处理,即先将睾丸复位,血流再灌注10s,然后将睾丸再次扭转720度,使睾丸缺血10s,反复6个循环,最后睾丸复位,血流持续灌注。复位后4h,每组处死大鼠10只,行左侧睾丸切除术,测定睾丸组织丙二醛水平。复位后3个月,各组处死剩余的大鼠,行左侧睾丸切除术,分析睾丸生精功能。结果睾丸组织丙二醛含量缺血后灌注组>缺血后处理组>处理组[(2.73±0.34)、(1.86±0.29)、(1.45±0.20)mmol/mg](P<0.05),睾丸生精功能对照组>缺血后处理组>缺血后灌注组[(22.03±1.97)、(15.13±1.81)、(2.14±0.42)×106](P<0.05)。结论缺血后处理对睾丸缺血再灌注损伤有保护作用,其作用机制可能与降低活性氧水平有关。

BMSCs来源的外泌体对大鼠睾丸缺血再灌注损伤的保护作用

目的探讨大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)来源的外泌体对睾丸缺血再灌注损伤的保护作用。方法采用原代培养方法分离、培养、并鉴定大鼠BMSCs。超高速离心法提取BMSCs来源的外泌体,并采用纳米颗粒跟踪分析仪(NTA)分析其粒径大小,透射电子显微镜观察其形态,蛋白免疫印迹法检测其典型标志蛋白质鉴定提取的外泌体。构建雄性SD大鼠睾丸缺血再灌注损伤(IRI)模型,24只健康雄性SD大鼠随机分为3组;A组:假手术组(Sham组),B组:生理盐水处理组(I/R+NS),C组:BMSCs来源外泌体(100μg/m L)处理组(I/R+BMSCs-exo)。最后取各组大鼠扭转侧(左侧)睾丸并用光学显微镜检测睾丸组织病理学结构改变以及对生精结构进行组织评分,采用生物化学的方法检测各组睾丸组织中超氧化物歧化酶的活性,丙二醛的含量,蛋白免疫印迹法检测高迁移率族蛋B1(HMGB1),含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3(caspases-3)和剪切型caspase-3的表达。结果成功从大鼠骨髓中原代分离并培养BMSCs,并成功提取了BMSCs分泌的外泌体。动物模型中,与睾丸生精结构正常的A组(Sham)相比,B组(I/R+NS)的睾丸生精结构明显有不同程度受损,而C处理组(I/R+BMSCs-exo)中有一定的改善(P<0.05)。睾丸组织生化指标检测中,B组(I/R+NS)组织中的MDA的含量较A组(Sham)明显升高,而SOD的活性与A组(Sham)相比则降低(P<0.01),而在经外泌体处理之后的C组(I/R+BMSCs-exo)中,与生理盐水处理组B组相比,组织中MDA的含量有一定程度降低而SOD的水平则上调(P<0.05)。睾丸组织蛋白免疫印迹上,与A组(Sham)相比,B组(I/R+NS)的HMGB1,caspase-3以及剪切型caspase-3明显升高,而C组(IR+BMSCs-exo)的HMGB1,caspase-3和剪切型caspase-3一定程度的降低(P<0.05)。结论 BMSCs来源的外泌体对睾丸缺血再灌注损伤有抗氧化,抗炎症和抗凋亡的保护作用。

牛磺酸对大鼠睾丸缺血再灌注损伤的影响

目的：睾丸扭转复位后的损伤是一种缺血再灌注损伤。本研究旨在探讨牛磺酸对睾丸缺血再灌注损伤的影响。方法60只成年雄性SD大鼠随机分为三组，对照组作左侧睾丸假手术；缺血再灌注组作左侧睾丸扭转，2h后复位；治疗组与缺血再灌注组用一样的外科手术，治疗组术后给予牛磺酸静脉注射，复位后4h或3个月行睾丸切除术，分析睾丸髓过氧化物酶活性（反映中性粒细胞数目的指标）、丙二醛水平（活性氧标志）和睾丸生精功能。结果单侧睾丸扭转复位引起该侧睾丸髓过氧化物酶活性、丙二醛水平明显升高，睾丸生精功能显著降低，牛磺酸治疗后睾丸髓过氧化物酶活性和丙二醛水平得到降低，睾丸生精功能得到显著提高。结论牛磺酸对睾丸缺血再灌注损伤具有明显的保护效应，该效应可能与减少睾丸内中性粒细胞数目和活性氧产生有关。

黄芩素减轻大鼠睾丸缺血再灌注损伤中的作用及其机制研究

研究PI3K蛋白在黄芩素减轻大鼠睾丸扭转缺血后再灌注损伤中的作用。方法:采用Turner法建立SD大鼠睾丸I/R损伤模型。36只健康且年龄7-8周的雄性SD品系大鼠(180-220g)不按照任何顺序分成3组,每组12只:虚拟手术组(对照组):无菌手术将左侧阴囊做手术切口,分离筋膜至附睾,沿精索游离至将左侧睾丸露出,不予扭转,固定于阴囊2小时返还阴囊,缝合手术切口;缺血再灌注组(模型组);缺血再灌注+黄芩素(黄芩素治疗组)。模型组和黄素治疗组麻醉后在左侧阴囊做无菌手术切口,游离精索至左侧睾丸并将睾丸露于阴囊外,沿睾丸纵轴方向顺向扭转720°,固定扭转状态2小时,恢复位置后闭合切口。复位前30min黄芩素治疗组腹腔注射17ml/kg的黄芩素生理盐水溶液,再于手术总时长4h后,所有试验动物颈椎离断处死,取睾丸组织精密称重后沿中轴切开,其中一半用于组织匀浆,检测各组睾丸组织中各项氧化应激标志物的水平,另一半用于制备石蜡切片。结果:与对照组相比,模型组和黄芩素治疗组睾丸组织均存在病理损伤,生精细胞减少,活性氧含量上升,超氧化物歧化酶活性降低,经免疫组织化学法测定PI3K蛋白表达水平较高。与扭转复位组相比,扭转复位+黄芩素组睾丸组织病理损伤较不明显,生精细胞减少较少,活性氧(ROS)含量上升幅度较小,超氧化物歧化酶(SOD)活性较高,PI3K蛋白表达水平更高。

芹菜素对睾丸缺血再灌注损伤大鼠模型的保护作用

本实验通过建立大鼠睾丸(左侧)缺血再灌注模型,初步探讨芹菜素(apigenin, AP)对损伤睾丸的保护作用。方法 30只雄性SD大鼠随机分为三组:假手术组、睾丸扭转组、芹菜素干预组。假手术组不行精索扭转,仅游离并暴露左侧睾丸,睾丸扭转组和芹菜素干预组行Turner法建立睾丸扭转复位模型,复位前30min,干预组腹腔注射6ml/kg浓度为2mol/l的AP生理盐水溶液,睾丸扭转组腹腔注射6ml/kg生理盐水,假手术组不注射液体。复位6h后处死大鼠,取大鼠左侧睾丸。光镜下观察组织病理结构变化,评估其生精功能,测定睾丸组织中SOD和MDA含量。结果 与假手术组相比,睾丸扭转组和AP干预组大鼠睾丸生精细胞层数均减少(6.33 vs 2.00,4.67),其中睾丸扭转组与假手术组间的差异有统计学意义(p<0.05),且AP干预组生精细胞层数显著高于睾丸扭转组(4.67 vs 2.00,p<0.05);三组大鼠睾丸生精小管基膜厚度的比较无明显差异;在SOD和MDA检测中,与假手术组相比,睾丸扭转组和AP干预组的SOD活性均降低(51.84 vs 26.55,37.77,p<0.05),MDA水平均升高(1.22 vs 2.30,1.66,p<0.05)。与睾丸扭转组相比,AP干预组大鼠睾丸组织中SOD活性显著升高(26.55 vs 37.77,p<0.05),MDA水平显著降低(2.30 vs1.66,p<0.05)。结论 芹菜素对大鼠睾丸缺血再灌注所致的损伤具有一定的保护作用。

胡黄连苷Ⅱ对大鼠睾丸缺血再灌注损伤的保护作用

目的探讨胡黄连苷Ⅱ在大鼠睾丸缺血再灌注损伤过程中的保护作用。方法选取成年雄性SD大鼠45只随机分为3组,每组15只:睾丸缺血再灌注+胡黄连苷Ⅱ组(睾丸IRI+胡黄连苷Ⅱ组);睾丸缺血再灌注组(睾丸IRI组);对照组。睾丸IRI组和睾丸IRI+胡黄连苷Ⅱ组大鼠分别建立睾丸扭转复位模型,睾丸IRI+胡黄连苷Ⅱ组在再灌注同时腹腔注射胡黄连苷Ⅱ(10 mg/kg)。HE染色观察睾丸组织病理改变;测定丙二醛(MDA)、超氧化物岐化酶(SOD)含量;采用原位缺口末端标记检测细胞凋亡指数;免疫组化检测睾丸组织中的Bax和Caspase-3的表达情况;RT-PCR检测TNF-α和IL-1βmRNA表达水平。结果睾丸IRI组可见生精上皮排列紊乱,生精细胞广泛脱落等表现;3组的凋亡指数分别为(4.28±0.36)%、(18.93±1.27)%、(9.53±1.02)%,SOD活性分别为(0.83±0.05)、(0.28±0.03)、(0.54±0.03)U/mg蛋白,MDA含量分别为(1.92±0.26)、(5.23±0.78)、(2.97±0.35)nmol/g蛋白,各组上述指标相互比较均有统计学意义(P<0.05);睾丸IRI组中Bax及Caspase-3表达明显高于对照组,睾丸IRI+胡黄连苷Ⅱ组明显改善IRI引起的表达变化;与对照组相比,睾丸IRI组中TNF-α和IL-1βmRNA表达水平明显增高。和睾丸IRI组比较,睾丸IRI+胡黄连苷Ⅱ组中TNF-α和IL-1βmRNA表达水平明显减低,各组上述指标相互比较均有统计学意义(P<0.05)。结论胡黄连苷Ⅱ可减轻氧化应激水平,发挥抗炎及抗凋亡作用,从而在睾丸组织在缺血再灌注损伤过程中发挥保护作用。

磷酸酶和张力蛋白同源物在睾丸缺血再灌注损伤中对GC-1细胞焦亡的影响及作用机制

目的探讨磷酸酶和张力蛋白同源物(PTEN)在睾丸缺血再灌注损伤(IRI)中对GC-1细胞焦亡的作用及其机制。方法建立睾丸GC-1细胞(美国ATCC细胞库)缺氧复氧模型,采用定量实时聚合酶链反应(qRT-PCR)检测不同复氧损伤时间点PTEN的表达变化;分别采用免疫荧光实验、蛋白质印迹法(Western blot)检测转染PTEN后对GC-1细胞焦亡相关蛋白NLRP3和Caspase-1表达水平的影响。组间比较采用t检验,多组间比较采用单因素方差分析。结果对照组及缺氧复氧组(0、6、12、24 h)PTEN的mRNA表达水平分别为(1.00±0.21、3.48±0.35、3.75±0.38、4.25±0.40、4.06±0.37)。与未缺氧GC-1细胞的对照组比较,随着复氧损伤时间的增加,PTEN表达明显增高,并在复氧12 h达到峰值(F=43.21,P<0.05)。Western blot结果显示,缺氧复氧组中NLRP3和Caspase-1表达水平(0.52±0.04、0.41±0.04)高于对照组(0.24±0.03、0.20±0.03,t=9.700,P<0.05;t=7.275,P<0.05)。过表达PTEN组中NLRP3和Caspase-1表达水平(0.75±0.06、0.62±0.05)高于其对照组(0.53±0.04、0.42±0.03)明显(t=5.284,P<0.05;t=5.941,P<0.05)。沉默PTEN组中NLRP3和Caspase-1表达水平(0.36±0.03、0.32±0.03)低于对照组(0.52±0.04、0.41±0.03)明显(t=-5.543,P<0.05;t=-3.674,P<0.05)。结论PTEN在GC-1细胞中呈高表达,其可能通过改变GC-1细胞焦亡水平,从而影响睾丸IRI的发生发展。

经腹腔及阴囊途径注射GYY4137对大鼠睾丸缺血再灌注损伤保护作用的比较

目的比较腹腔内与阴囊内注射GYY4137对大鼠睾丸缺血再灌注损伤的治疗作用.方法选取健康成年雄性SD大鼠40只随机分为4组,每组10只,对照组(A组)、睾丸缺血再灌注损伤组(B组)、睾丸缺血再灌注损伤+GYY4137腹腔给药组(C组)、睾丸缺血再灌注损伤+GYY4137阴囊给药组(D组).A组为假手术组,B、C、D组大鼠建立单侧睾丸扭转复位模型,C组和D组在复位前分别腹腔内和阴囊内注射GYY4137(100μmol/kg).复位4h后取左侧睾丸待测.苏木精-伊红(HE)染色观察睾丸组织病理改变;测定丙二醛(MDA)、超氧化物岐化酶(SOD)含量;以原位缺口末端标记法(TUNEL)检测生精细胞凋亡指数;采用免疫组织化学检测B细胞淋巴瘤/白血病-2相关X蛋白(bax)和半胱氨酰天冬氨酸特异性蛋白酶(Caspase)-3的表达水平;蛋白质印迹法(Westem blot)检测肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和白细胞介素(IL)-1β蛋白表达水平;实时定量反转录聚合酶链反应(RT-qPCR)方法检测睾丸组织中bax、Caspase-3、TNF-α和IL-1β表达水平,应用SPSS20.0统计软件分析,计量资料以均值±标准差(Mean±SD)表示.结果B组可见生精细胞广泛脱落坏死,上皮排列紊乱.与B组比较,C、D组损伤明显改善;B组中MDA含量(5.13±0.26)与A组(1.21±0.20)比较显著上升(t=37.790,P<0.05),SOD含量(0.22±0.04)与A组(0.86±0.05)比较显著下降(t=30.710,P<0.05);与B组比较,C和D组MDA含量(3.26±0.23、2.42±0.24)明显下降(t=17.040、24.220,P<0.05),SDA含量(0.42±0.04、0.58±0.04)显著上升(t=11.450、20.070,P<0.05);B组凋亡指数(33.56±1.45)比A组(6.35±1.12)显著增高(t=46.960,P<0.05),C组和D组凋亡指数(22.58±1.67、17.86±1.65)与B组比较明显下降(t=15.700、22.600,P<0.05);免疫组化结果显示B组中bax和Caspase-3的表达水平较A组显著增加,C组和D组较之明显降低;B组TNF-α(0.774±0.042)和IL-1β(0.674±0.037)的表达水平与A组(0.147±0.022、0.136±0.018)比较明显增高(t=41.820、41.350,P<0.05),C组(0.425±0.029、0.417±0.030)和D组(0.331±0.027、0.308±0.025)较之明显降低(t=21.620、17.060、28.060、25.920,P<0.05);PCR结果显示,与B组(5.35±0.43、3.76±0.31、4.35±0.31、3.86±0.34)比较,C组(3.86±0.32、2.56±0.21、3.08±0.25、2.92±0.28)和D组(3.78±0.36、2.23±0.22、2.96±0.26、2.56±0.25)bax、Caspase-3、TNF-α和IL-1β的表达降低均有所下降(t=8.790、10.130、10.080、6.750、8.850、12.730、10.860、9.740,P<0.05),D组下降程度较显著.结论GYY4137对大鼠睾丸缺血再灌注损伤具有明显的保护作用,阴囊内给药的疗效与腹腔内给药比较更佳.

小鼠睾丸缺血-再灌注损伤过程中Hsp60的变化及其作用

目的观察小鼠睾丸扭转导致的缺血-再灌注损伤过程中Hsp60的变化及其抗凋亡作用。方法制备小鼠睾丸的缺血-再灌注模型:小鼠睾丸逆转720°,造成缺血2h,然后复位,分别对复位24h、48h、72h的组织进行Hsp60mRNA表达水平、免疫组化以及凋亡水平的检测。结果检查显示Hsp60在小鼠睾丸的缺血-再灌注后表达高于正常水平,相应的细胞凋亡减少。结论推测Hsp60在缺血状态应激高表达,暂时抑制细胞凋亡,保护机体以减少损伤。

LncRNA H19/miR-203a/PTEN轴在小鼠GC-1细胞缺血再灌注损伤中的作用及影响机制

目的:探讨长链非编码RNA(lncRNA)H19在小鼠体外GC-1细胞的表达,以及其通过调控微小RNA(miRNA)-203a/磷酸酯酶与张力蛋白同源物(PTEN)轴对GC-1细胞凋亡和增殖的影响。方法:建立GC-1细胞体外缺氧复氧模型,qRT-PCR检测GC-1细胞不同复氧损伤时间点lncRNA H19的表达变化;MTT法、流式细胞术测定沉默lncRNA H19对GC-1细胞增殖和凋亡的影响;Western印迹检测沉默lncRNA H19对GC-1细胞凋亡相关蛋白Bax和caspase-3表达的影响;qRT-PCR和Western印迹分别测定沉默lncRNA H19后GC-1细胞miR-203a和PTEN的表达变化。结果:随着复氧损伤时间的增加,GC-1细胞lncRNA H19表达明显增加,在缺氧3 h/复氧12 h达到峰值,与此同时miR-203a表达明显降低。此外,沉默lncRNA H19增强了GC-1细胞的增殖能力并降低了其凋亡水平,增加了miR-203a表达水平并降低了PTEN表达水平,结果显著。结论:LncRNA H19在体外GC-1细胞中高表达,其可能通过调控miR-203a/PTEN信号途径改变GC-1细胞增殖及凋亡的能力。

白藜芦醇苷对大鼠睾丸扭转缺血和再灌注损伤的保护作用

目的探讨白藜芦醇苷对大鼠睾丸扭转的保护作用。方法选取4周龄雄性SD大鼠36只,随机分为3组:假手术组(A组)、扭转复位组(B组)、扭转复位+白藜芦醇苷组(C组)。B组和C组大鼠建立睾丸扭转复位模型,A组不扭转。扭转4 h后复位睾丸,复位前15 min B组腹腔注射生理盐水1 ml;C组腹腔注射白藜芦醇苷1 ml(5.0 mg/kg)。复位后4 h处死所有动物取睾丸待测。以原位缺口末端标记法(TUNEL)检测生精细胞凋亡指数;化学比色法测定睾丸组织中总抗氧化能力(T-AOC)活性,羟胺法测定超氧化物歧化酶(SOD)活性,TBA法测定丙二醛(MDA)含量;精密称重睾丸后睾丸组织HE染色观察组织形态变化。结果 B组T-AOC[(20.31±2.55)U/mg]、SOD[(72.76±5.58)U/mg]比A组[(33.62±3.29)U/mg]、[(165.33±5.42)U/mg]明显降低,差异有统计学意义(P<0.05),而C组T-AOC[(30.05±2.08)U/mg]、SOD[(103.15±14.16)U/mg]较B组明显升高(P<0.05)。B组MDA[(42.38±8.94)U/mg]比A组[(11.51±1.89)U/mg]明显升高,差异有统计学意义(P<0.05),而C组[(23.87±4.47)U/mg]较B组明显减低(P<0.05);C组凋亡指数[(12.2±1.34)%]较B组显著下降(P<0.05);B组睾丸扭转复位后损伤的组织学改变较A组损伤明显;生精小管变薄,细胞脱落坏死。C组的组织学改变较B组明显改善;生精小管变薄减少,细胞脱落坏死减少。结论白藜芦醇苷具有明显对抗睾丸扭转复位后的氧化损伤,对因睾丸扭转导致的缺血再灌注损伤具有保护作用。