TRPV1基因过表达逆转录病毒载体的构建和鉴定

目的 TRPV1基因过表达逆转录病毒载体的构建和鉴定研究。方法 PCR法扩增TRPV1基因的编码序列,克隆到pBaBe-puro载体上。对重组质粒进行DNA序列测定和酶切分析。用磷酸钙法制备pBaBe-puro-TRPV1逆转录病毒,将其感染到U87-MG细胞,经嘌呤酶素筛选阳性克隆后用荧光定量PCR和Western blot法检测TRPV1表达。结果经DNA测序和酶切鉴定表明,pBaBe-puro-TRPV1表达载体构建成功。pBaBe-puroTRPV1逆转录病毒感染U87-MG细胞后,细胞中TRPV1表达量明显增高。结论成功构建了人TRPV1基因的pBaBe-puro-TRPV1表达载体。pBaBe-puro-TRPV1能有效上调TRPV1基因在U87-MG细胞中的表达,为应用其研究TRPV1在利多卡因致细胞损伤中的作用奠定了基础。

TRPV1基因的shRNA逆转录病毒载体的构建和鉴定

目的构建针对人瞬态电压感受器阳离子通道,子类V,成员1(TRPV1)基因的p SUPERretro-puro TRPV1逆转录病毒表达载体,感染U87-MG细胞,观测其沉默TRPV1基因的效果。方法利用Ambion在线设计软件设计针对人TRPV1基因的sh RNA干扰序列,克隆到p SUPERretro-puro载体上。对重组质粒进行DNA序列测定和酶切分析。用磷酸钙法制备p SUPERretro-puro TRPV1逆转录病毒,将其感染到U87-MG细胞,经嘌呤酶素筛选阳性克隆后采用荧光定量PCR及Western blotting法检测TRPV1表达。结果经DNA测序和酶切鉴定表明,p SUPERretro-puro TRPV1表达载体构建成功。p SUPERretropuro TRPV1逆转录病毒感染U87-MG细胞后,细胞中TRPV1表达量明显降低。结论成功构建了针对人TRPV1基因的p SUPERretro-puro TRPV1表达载体。p SUPERretro-puro TRPV1能有效下调TRPV1基因在U87-MG细胞中的表达,为将来应用其研究TRPV1在利多卡因致细胞损伤中的作用奠定了基础。

辣椒素受体干预大鼠周围神经压榨性损伤后再生

目的:于大鼠坐骨神经压榨性损伤模型基础上观察辣椒素受体拮抗剂AMG517对神经损伤后再生过程的影响。方法:采用2.5%戊二醛固定标本、1%四氧化锇后固定、分别制备半薄切片(1μm)和超薄切片(60nm)、并进行甲苯胺蓝及醋酸铀-枸橼酸铅染色,对一侧坐骨神经损伤的损伤近端、损伤中心及损伤远端之有髓及无髓神经的数量及其结构特点进行观察和计数。结果:坐骨神经压榨性损伤后,损伤远端发生Wallerian变性,尔后,由损伤近端逐渐开始出现神经突起及雪旺细胞的再生。如果损伤前30 min于同侧足底皮下注射辣椒素受体拮抗剂ANG517(300μg/kg BW)后,损伤近端(距损伤中心0.2 cm)、损伤中心及损伤远端(距损伤中心0.2 cm)部位有髓和无髓神经簇再生的数量明显多于未用药组,尤以损伤后2周时表现更为明显。结论:辣椒素受体作为位于周围神经末梢的伤害性感受器,其功能状态的变化可以影响神经再生过程;抑制辣椒素受体可以加快或促进周围神经损伤后再生。