基于瞬时受体电位香草素亚家族4信号通路探讨牛蒡子苷元对体外培养软骨细胞增殖及Ⅱ型胶原蛋白和软骨蛋白聚糖表达的影响

目的:基于瞬时受体电位香草素亚家族4(transient receptor potential vanilloid 4,TRPV4)信号通路探讨牛蒡子苷元对体外培养软骨细胞增殖及Ⅱ型胶原蛋白和软骨蛋白聚糖表达的影响。方法:自新生SD大鼠膝关节软骨组织提取软骨细胞,进行体外培养,取第1代软骨细胞分别加入不同培养液进行干预。空白组仅加入常规培养液,牛蒡子苷元组加入含10μmol牛蒡子苷元的培养液,牛蒡子苷元联合阻断剂组加入含10μmol牛蒡子苷元和10μmol GSK205的培养液,激动剂组加入含1μmol 4α-PPD的培养液,阻断剂联合激动剂组加入含10μmol GSK205和1μmol 4α-PPD的培养液,阻断剂组加入含10μmol GSK205的培养液。分别于干预24 h和72 h后以CCK-8法检测软骨细胞增殖情况,48 h后以Western blot法检测软骨蛋白聚糖和Ⅱ型胶原蛋白水平。结果:(1)软骨细胞增殖测定结果。干预24 h后,6组的吸光度比较,差异有统计学意义(1.03±0.72,1.32±0.11,1.01±0.05,1.33±0.34,1.04±0.50,1.10±0.06;F=18.309,P=0.000)。牛蒡子苷元组、激动剂组的吸光度均高于空白组(P=0.000,P=0.000);牛蒡子苷元联合阻断剂组、阻断剂联合激动剂组、阻断剂组的吸光度与空白组比较,组间差异均无统计学意义(P=0.632,P=0.840,P=0.164);牛蒡子苷元组的吸光度高于牛蒡子苷元联合阻断剂组、阻断剂联合激动剂组(P=0.000,P=0.000);牛蒡子苷元组与激动剂组比较,差异无统计学意义(P=0.834);牛蒡子苷元联合阻断剂组的吸光度低于激动剂组(P=0.000),与阻断剂联合激动剂组比较,差异无统计学意义(P=0.498);激动剂组的吸光度高于阻断剂联合激动剂组(P=0.000)。干预72 h后,6组的吸光度比较,差异有统计学意义(1.66±0.02,2.21±0.05,1.84±0.04,1.92±0.07,1.71±0.10,1.74±0.08;F=37.629,P=0.000)。牛蒡子苷元组、牛蒡子苷元联合阻断剂组、激动剂组的吸光度均高于空白组(P=0.000,P=0.001,P=0.000);阻断剂联合激动剂组、阻断剂组与空白组比较,组间差异均无统计学意义(P=0.326,P=0.104);牛蒡子苷元组的吸光度高于牛蒡子苷元联合阻断剂组、激动剂组及阻断剂联合激动剂组(P=0.000,P=0.000,P=0.000);牛蒡子苷元联合阻断剂组的吸光度低于激动剂组(P=0.010),与阻断剂联合激动剂组比较,差异无统计学意义(P=0.098);激动剂组的吸光度高于阻断剂联合激动剂组(P=0.000)。(2)软骨蛋白聚糖和Ⅱ型胶原蛋白水平测定结果。5组软骨细胞中软骨蛋白聚糖水平比较,差异有统计学意义(1.00±0.00,20.74±5.01,4.20±0.66,22.87±1.82,2.09±0.63;F=194.544,P=0.000)。牛蒡子苷元组、激动剂组的软骨蛋白聚糖水平均高于空白组(P=0.000,P=0.000);牛蒡子苷元联合阻断剂组、阻断剂联合激动剂组与空白组比较,组间差异均无统计学意义(P=0.136,P=0.593);牛蒡子苷元组的软骨蛋白聚糖水平高于牛蒡子苷元联合阻断剂组、阻断剂联合激动剂组(P=0.000,P=0.000);牛蒡子苷元组与激动剂组比较,差异无统计学意义(P=0.305);牛蒡子苷元联合阻断剂组的软骨蛋白聚糖水平低于激动剂组(P=0.000),与阻断剂联合激动剂组比较,差异无统计学意义(P=0.310);激动剂组的软骨蛋白聚糖水平高于阻断剂联合激动剂组(P=0.000)。5组软骨细胞中Ⅱ型胶原蛋白水平比较,差异有统计学意义(1.00±0.00,2.94±0.11,1.92±0.17,2.04±0.12,0.78±0.09;F=58.701,P=0.000)。牛蒡子苷元组、牛蒡子苷元联合阻断剂组、激动剂组的Ⅱ型胶原蛋白水平均高于空白组(P=0.000,P=0.000,P=0.000);阻断剂联合激动剂组的Ⅱ型胶原蛋白水平低于空白组(P=0.032);牛蒡子苷元组的Ⅱ型胶原蛋白水平高于牛蒡子苷元联合阻断剂组、激动剂组、阻断剂联合激动剂组(P=0.000,P=0.000,P=0.000);牛蒡子苷元联合阻断剂组的Ⅱ型胶原蛋白水平高于阻断剂联合激动剂组(P=0.000),与激动剂组比较,差异无统计学意义(P=0.193);激动剂组的Ⅱ型胶原蛋白水平高于阻断剂联合激动剂组(P=0.000)。结论:牛蒡子苷元可通过TRPV4信号通路促进体外培养软骨细胞的增殖及软骨细胞中Ⅱ型胶原蛋白和软骨蛋白聚糖的表达。

瞬时感受器电位离子通道香草素受体4下游信号分子的确定及其对大鼠背根神经节慢性压迫后痛觉过敏的作用

目的:探讨大鼠背根神经节慢性压迫CCD后瞬时感受器电位离子通道香草素受体4(TRPV4)下游信号分子及其在痛觉过敏中的机制。方法:鞘内分别注射TRPV4拮抗剂钌红(RR)、TRPV4反义寡脱氧核苷酸(ASODN)和一氧化氮合成酶(NOS)抑制剂L-NAME,检测CCD大鼠背根神经节DRG内一氧化氮(NO)代谢产物亚硝酸盐(nitrite)含量变化,并观测热刺激缩爪反应潜伏期(PWL)的变化。结果:鞘内分别注射RR、TRPV4 AS ODN和L-NAME后,均能够显著降低CCD大鼠DRG内亚硝酸盐含量(P<0.05),CCD大鼠的热痛敏行为也能够显著改善(P<0.05)。结论:TRPV4及其下游信号分子NO参与介导CCD大鼠的热痛觉过敏。

香草素受体4型瞬时感受器电位通道及其抑制剂与相关呼吸系统疾病关系的研究进展

香草素受体4型瞬时感受器电位(TRPV4)通道是瞬时感受器电位通道家族成员之一,是一种对钙离子具有选择通透性的阳离子通道。该通道激活后可引起胞内钙离子浓度升高,进而参与调节机体多种生理或病理过程。近年来大量文献表明,TRPV4通道可能与多种呼吸系统疾病的发病机制有关,包括急性肺损伤、慢性阻塞性肺疾病、肺动脉高压、特发性肺纤维化和哮喘等,TRPV4抑制剂的应用可不同程度地缓解上述疾病进展。本文对TRPV4通道及其抑制剂与有关呼吸系统疾病关系的研究进展予以综述。

抑制瞬时感受器电位香草素受体亚家族Ⅳ型通道对大鼠视网膜缺血-再灌注损伤后细胞凋亡与新生血管生成的作用

目的探讨抑制瞬时感受器电位香草素受体亚家族Ⅳ型(TRPV4)通道对大鼠视网膜缺血-再灌注损伤(RIRI)细胞凋亡和血管形成的影响。方法将30只SD大鼠分为对照组、RIRI组和RIRI+HC-067047组,每组10只。采用高眼压法建立大鼠RIRI模型,RIRI+HC-067047组在造模后5、10 h通过侧脑室注射HC-067047(5μmol/μL),对照组和RIRI组给予同等剂量的生理盐水。测量各组大鼠治疗后第7天、第14天与第21天的体质量,于治疗第21天观察大鼠视网膜组织形态变化和视网膜组织神经细胞凋亡情况,检测各组大鼠视网膜组织半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(Caspase-3)、血管内皮生长因子(VEGF)蛋白阳性表达情况,VEGF、核因子E2相关因子2(Nrf2)、缺氧诱导因子1α(HIF-1α)mRNA的相对表达水平,以及色素上皮衍生因子(PEDF)、胶质纤维酸性蛋白质(GFAP)、Caspase-3、B细胞淋巴瘤-2(Bcl-2)及Bcl-2相关X蛋白(Bax)的相对表达水平。结果与对照组比较,治疗后第21天RIRI组大鼠体质量下降,RIRI组和RIRI+HC-067047组视网膜组织神经细胞凋亡增加,Caspase-3、VEGF蛋白阳性表达率增加,Nrf2、VEGF、HIF-1αmRNA相对表达水平升高,PEDF、Bcl-2蛋白表达水平下降而GFAP、Caspase-3、Bax蛋白表达水平升高(均P<0.05)。与RIRI组比较,治疗后第21天,RIRI+HC-067047组视网膜神经细胞凋亡数目减少,Caspase-3、VEGF蛋白阳性表达率下降,Nrf2、VEGF、HIF-1αmRNA相对表达水平下降,PEDF、Bcl-2蛋白表达水平升高而GFAP、Caspase-3、Bax蛋白表达水平下降(均P<0.05)。结论抑制TRPV4通道可改善大鼠RIRI,其机制可能与抑制视网膜细胞凋亡与减少血管新生有关。

温敏离子通道蛋白TRPV4受热激活参与相关疾病发生的机制研究进展

发热是机体应对感染和损伤的一种病理性防御反应。瞬时感受器电位离子通道香草素受体4(TRPV4)是瞬时感受器电位离子通道家族的成员,在机体中广泛表达,对体温具有负调节作用。当机体温度升高激活TRPV4或使其表达增多时,可引起脑水肿和癫痫发作的加剧;TRPV4的活性及正常表达影响新生儿面部与心脏缺陷和精子活动趋热性。通过对TRPV4的多方面研究,有望揭示TRPV4受热激活下与疾病的具体机制,探索新的药物作用靶点和开发新的药物等。

青蒿素对氧化低密度脂蛋白诱导的血管内皮细胞损伤的作用及机制

目的探讨青蒿素(ART)对氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)诱导的血管内皮细胞损伤的作用及其潜在的分子机制。方法分别用0、50、100、150、200 mg/ml的ox-LDL及0、1、5、10、20 mmol/L的ART处理对数生长期的人脐静脉内皮细胞EA.hy926,采用MTT法检测细胞活性。为检测ART对细胞的影响,将EA.hy926细胞分为4组:对照组(无处理)、ox-LDL组(100 mg/ml ox-LDL)、ox-LDL+ART组(100 mg/ml ox-LDL+10 mmol/L ART)及ox-LDL+ART+3-甲基腺嘌呤(3-MA)组(100 mg/ml ox-LDL+10 mmol/L ART+5 mmol/L 3-MA);为检测瞬时感受器电位通道香草酸受体亚型Ⅳ(TRPV4)对细胞的影响,将EA.hy926细胞分为4组:对照组、ox-LDL组、ox-LDL+ART组及ox-LDL+ART+钌红(RR)组(100 mg/ml ox-LDL+10 mmol/L ART+10 mmol/L RR)。采用MTT法检测细胞活性,Western blotting检测TRPV4、自噬相关蛋白(LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、p62)及凋亡相关蛋白(Bcl-2、Bax)的表达,流式细胞仪检测细胞凋亡情况。结果EA.hy926细胞活性随着ox-LDL浓度的升高而降低,而ART作用于ox-LDL诱导的细胞后,细胞活性明显升高(P<0.05)。与对照组比较,ox-LDL组细胞活性,p62、Bcl-2、TRPV4表达水平明显降低,而LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值、细胞凋亡率、Bax表达水平明显升高,差异均有统计学意义(P<0.05)。与ox-LDL组比较,ox-LDL+ART组细胞活性、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值、Bcl-2及TRPV4表达水平明显升高,而细胞凋亡率、Bax及p62表达水平明显降低,差异均有统计学意义(P<0.05)。与ox-LDL+ART组比较,ox-LDL+ART+3-MA组及ox-LDL+ART+RR组细胞活性、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值、Bcl-2表达水平明显降低,细胞凋亡率、p62及Bax表达水平明显升高,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论ART可通过激活TRPV4促进细胞自噬,从而减轻ox-LDL诱导的血管内皮细胞损伤。

TRPV4通道在正畸牙齿移动中的研究进展

正畸牙齿移动是临床正畸治疗的关键环节,通过在牙齿上施加合适的正畸力,正畸力传递至牙周会引起牙齿周围软硬组织的适应性改建。瞬时受体电位香草素受体4型通道蛋白(transient receptor potential vanilloid 4 channel,TRPV4)是一个作用繁多、机制复杂的机械敏感性钙离子通道蛋白,在调控机械力的传导、炎症反应等方面都发挥着重要的作用,近年来陆续有研究者发现TRPV4通道也参与了正畸牙齿移动。本文就TRPV4通道在正畸牙齿移动中发挥的作用作一综述,以期为临床正畸治疗提供理论依据。

高糖环境下大鼠DRG神经元中PKCε和TRPV4 mRNA的表达

目的观察高糖环境对大鼠背根神经节(DRG)细胞瞬时感受器电位离子通道香草素受体4(TRPV4)﹑蛋白激酶Cε(PKCε)mRNA表达的影响,明确高糖环境对以上2种受体的调控作用。方法急性分离新生大鼠DRG细胞,培养48 h后更换培养液并分组。按照培养基含糖量不同分为:对照组(5.5 mmol/L,C组)、高糖1组(17.5 mmol/L,H1组)、高糖2组(35.0 mmol/L,H2组)。换液后48 h提取细胞总RNA并进行逆转录。用RT-PCR及实时定量PCR检测TRPV4和PKCεmRNA表达的变化。结果与对照组比较,PKCεmRNA在H1组表达没有明显变化(P>0.05),而在H2组表达显著上调(P<0.05)。与对照组比较,TRPV4 mRNA在H1组表达显著上调(P<0.05),而在H2组表达没有明显变化(P>0.05)。结论高糖环境可以上调TRPV4/PKCε基因的表达,但是2种基因明显上调时糖浓度不一致,说明TRPV4的激活除了PKCε的调控外还受其它因素调节。

TRPV4在皮肤免疫性大疱病中的表达及意义

目的探讨TRPV4蛋白在寻常型天疱疮(PV)、大疱性类天疱疮(BP)、疱疹样皮炎(DH)、获得性大疱性表皮松解症(EBA)中的作用机制。方法用免疫组化方法检测正常皮肤组织、PV、BP、DH及EBA皮损组织中TRPV4蛋白的表达量。结果 TRPV4在PV(61.90%)、BP(81.81%)、DH(72.22%)、EBA(68.42%)的阳性率均低于正常皮肤组织(93.33%),且各类疾病间亦存在表达差异(PV<EBA<DH<BP)。结论 TRPV4蛋白的低表达可能影响着皮肤连接的形成或修复,参与皮肤免疫性大疱病的发生、发展。

TRPV4-SK_(Ca)在老年大鼠气管平滑肌中改变及对其收缩的影响

目的阐明瞬时受体电位离子通道家族(TRP)中香草素受体亚家族(TRPV)成员TRPV4和小电导钙激活钾通道3(SK3)复合物对老年大鼠气管平滑肌收缩的影响。方法运用离体气管张力实验,观察高钾、卡巴胆碱对年轻、老年大鼠气管收缩的影响,以及瞬时受体电位离子通道TRPV4特异性激动剂和抑制剂对卡巴胆碱引起的气管收缩的影响;运用Western blot法检测TRPV4和SK3在年轻、老年大鼠气管平滑肌上表达量的变化。结果与年轻大鼠比较,老年大鼠高钾引起的气管收缩没有显著改变,但卡巴胆碱引起的收缩显著增强,且TRPV4激动剂GSK引起的舒张反应显著降低;两组大鼠用TRPV4阻断剂HC或RN1734预处理后,GSK引起的舒张反应均被显著阻断;Western blot结果显示,与年轻大鼠比较,老年大鼠气管平滑肌组织TRPV4表达显著升高,SK3表达却显著降低。结论 TRPV4-SK3信号复合物在老年大鼠气管平滑肌表达改变可能与老年大鼠气管舒张效应减弱有密切关系。

TRPV1/TRPV4和CEACAM6共表达与结直肠癌患者总生存期的关系

目的探讨辣椒素受体(TRPV1)及瞬时性受体电位通道香草酸受体4(TRPV4)与癌胚抗原相关细胞黏附分子6(CEACAM6)共表达对结直肠癌(CRC)患者预后的影响。方法使用GEPIA交互分析软件根据基因表达中值将620例CRC患者分为高表达和低表达两组(中值1例不入组),以设定阈值对TCGA和GTEX数据库中TRPV1和TRPV4基因的表达量进行log2(TPM+1)转换及差异分析,采用Wilcoxon检验分析TRPV1/TRPV4和CEACAM6基因共表达与CRC患者总体生存期(OS)的关系,采用基因组数据分析及免疫组化染色法对上述结果进行验证。结果CRC患者癌组织中TRPV1的表达量显著低于癌旁组织(1.70±0.51 vs 3.10±0.46,t=-53.56,P<0.01),而TRPV4显著高于癌旁组织(1.47±0.78 vs 0.67±0.33,t=25.98,P<0.01)。TRPV1和CEACAM6双高表达组CRC患者的OS显著高于CEACAM6单高表达患者(中位OS:6.8年vs 5.5年,log-rank P=0.0479)。结论检测TRPV1及TRPV4水平可有效评估CEACAM6高表达CRC患者的预后。

肠胶质细胞系TRPV4依赖性Ca^(2+)内流、ATP释放与炎症因子表达

目的探讨瞬时感受器电位离子通道香草素受体4(transient receptor potential vanilloid 4,TRPV4)在调节肠胶质细胞外Ca^(2+)内流中的作用及其意义。方法收集大鼠肠胶质细胞系CRL-2690、大鼠肠上皮细胞系IEC6和人胚肾细胞系HEK293T样本,采用RT-qPCR、Western blot和免疫荧光方法检测TRPV4的mRNA、蛋白表达与定位;将CRL-2690细胞依次分为GSK组与GSK+HC组,低渗组与低渗+HC组,GdCl_(3)组与GdCl_(3)+HC组以及CaCl_(2)组与CaCl^(2+)HC组,采用Fura-2荧光探针和单细胞荧光Ca^(2+)检测仪评估CRL-2690细胞中TRPV4通道活性。将CRL-2690细胞分为对照组、GSK组与GSK+HC组,通过荧光素-荧光素酶实验测量细胞ATP的释放水平;采用RT-qPCR检测炎症相关基因GFAP、IL-1β、IL-6、IL-10的mRNA表达。结果在大鼠肠胶质细胞系CRL-2690中检测到TRPV4 mRNA和蛋白表达;TRPV4特异性激动剂GSK1016790A和低渗透压刺激明显增强了CRL-2690细胞内钙荧光强度,而TRPV4特异性抑制剂HC067047可抑制此作用(0.43038±0.06365 vs 0.00423±0.00578,P<0.0001);钙敏感受体(calcium-sensing receptor,CaSR)激活诱导的外Ca^(2+)内流也可被HC067047所抑制(P<0.05);功能上,激活TRPV4可促ATP释放、EGC反应性增生标志物GFAP和炎症因子IL-1β、IL-6的表达,并抑制抗炎因子IL-10的表达,该作用可被HC067047所抑制(P<0.05)。结论激活TRPV4可引起肠胶质细胞外Ca^(2+)内流,并促进ATP释放与炎症因子表达,可能参与肠道炎症的发生。

牛膝多糖通过阻断PPARγ/TRPV4通路抑制大鼠骨髓间充质干细胞成脂分化

目的探讨牛膝多糖(ABPS)对骨髓间充质干细胞(BMSC)成脂分化的影响及作用机制。方法取5只SD大鼠处死后解剖并分离其BMSC,鉴定后贴壁传代培养至对数生长期,用不同剂量ABPS作用48 h,噻唑蓝(MTT)法检测细胞存活率,选择对BMSC生长无毒性的ABPS最高浓度进行后续实验。将细胞随机分为对照组、ABPS组、罗格列酮组和ABPS联合罗格列酮组,MTT法检测细胞存活率,分光光度法检测BMSC中甘油三酯(TG)水平,油红O染色观察BMSC中脂滴形成情况,实时定量PCR和Western blot法分别检测过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARγ)、瞬时受体电位香草素通道蛋白4(TRPV4)、转录因子CCAAT/增强子结合蛋白α(C/EBPα)的mRNA和蛋白表达。结果ABPS≤200 mg/L作用BMSC 48 h对BMSC生长无明显毒性作用,400 mg/L ABPS组细胞存活率降低。与对照组比较,200 mg/L ABPS处理组细胞TG水平降低,PPARγ、TRPV4、C/EBPαmRNA和蛋白相对表达量降低,胞质脂滴数量减少,罗格列酮组细胞存活率降低,TG水平升高,PPARγ、TRPV4、C/EBPαmRNA和蛋白相对表达量升高,胞质脂滴数量增多;与ABPS组比较,ABPS联合罗格列酮组细胞存活率降低,TG水平升高,PPARγ、TRPV4、C/EBPαmRNA和蛋白相对表达量升高,胞质脂滴数量增多;与罗格列酮组比较,ABPS联合罗格列酮组细胞存活率升高,TG水平降低,PPARγ、TRPV4、C/EBPαmRNA和蛋白相对表达量降低,胞质脂滴数量减少。结论ABPS可以抑制BMSC成脂分化,可能与阻断PPARγ/TRPV4通路有关。

TRPV4活化调控炎性小体Nod样受体家族3在小鼠膀胱上皮细胞损伤中作用和机制研究

目的探讨瞬时受体电位离子通道香草素受体亚家族4(transient receptor potential vanilloid receptor 4, TRPV4)通道活化在小鼠原代培养的膀胱上皮细胞损伤中的作用及其分子机制。方法小鼠1只,原代培养膀胱上皮细胞,并分为对照组、刺激组、β-羟基丁酸(β-hydroxybutyrate, BHB)预处理组和细胞因子释放抑制药物3(cytokine release inhibitory drug 3, MCC950)预处理组,刺激组采用TRPV4激动剂GSK1016790A 100μmol/L进行刺激;BHB预处理组和MCC950预处理组分别给予10 mmol/L BHB和50μmol/L MCC950后采用TRPV4激动剂GSK1016790A进行刺激;对照组正常培养。4组细胞采用Calcein-AM/PI双染色法观察活细胞数和死细胞数;采用乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase, LDH)细胞毒实验检测细胞LDH水平;采用Western blot法检测刺激组GSK1016790A刺激前及刺激3、6、9 h时细胞Nod样受体家族含pyrin结构域蛋白3(Nod-like receptor family pyrin domain-containing protein 3, NLRP3)及其下游活化产物胱冬肽酶-1(caspase-1 p10)相对表达量。结果刺激组Calcein-AM染色的活细胞数[(46.80±15.51)个]较对照组[(1 242.20±143.79)个]、BHB预处理组[(1 001.20±115.41)个]和MCC950预处理组[(1 144.00±138.62)个]减少(P<0.05),BHB预处理组、MCC950预处理组少于对照组(P<0.05),BHB预处理组与MCC950预处理组比较差异无统计学意义(P>0.05);刺激组PI染色的死细胞数[(1 111.60±127.49)个]较对照组[(33.80±8.41)个]、BHB预处理组[(251.80±48.67)个]和MCC950预处理组[(265.20±31.57)个]增多(P<0.05),BHB预处理组、MCC950预处理组多于对照组(P<0.05),BHB预处理组与MCC950预处理组比较差异无统计学意义(P>0.05);刺激组LDH水平[(85.27±7.18)u/L]高于对照组[(22.47±2.94)u/L]、BHB预处理组[(35.74±4.32)u/L]和MCC950预处理组[(37.09±4.09)u/L](P<0.05),BHB预处理组、MCC950预处理组高于对照组(P<0.05),BHB预处理组与MCC950预处理组比较差异无统计学意义(P>0.05);刺激组GSK1016790A刺激3、6、9 h时细胞中NLRP3(0.68±0.07、0.86±0.08、0.79±0.09)、caspase-1 p10表达量(0.68±0.06、0.51±0.07、0.47±0.05)均高于刺激前(0.36±0.05、0.24±0.06)(P<0.05)。结论 TRPV4可通过活化炎性小体NLRP3导致小鼠膀胱上皮细胞损伤,调控TRPV4-NLRP3可能为膀胱过度活动症治疗提供新靶点。

TRPV1激动剂通过MAPK信号通路调节缺血/再灌注大鼠心肌自噬的作用研究

目的探讨瞬时受体电位香草素1型(TRPV1)介导的丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路对缺血/再灌注(I/R)大鼠心肌自噬的调控及其在损伤修复中的作用。方法将24只成年雄性大鼠随机分为假手术组、I/R组(模型)、I/R+Capsaicin(CS)组,每组8只。除假手术组外,其他组建立I/R模型。建模前5 min,I/R+CS组大鼠腹腔注射CS(TRPV1激动剂,剂量为20 mg/kg)。通过超声心动图评估心脏功能。使用伊文思蓝(EB)/2,3,5-三苯基四氮唑染色(TTC)估计梗塞面积。定量免疫印迹分析自噬体和自噬体相关蛋白。将H9c2细胞分为对照(Con)组、缺氧/复氧(H/R)组、H/R+Capsaicin(CS)组、H/R+CS+Anisomycin(p38激动剂)组,通过用mCherry-GFP-LC3腺病毒评估各组细胞的自噬通量。结果与假手术组相比,I/R组的射血分数和缩短分数均显著降低,并出现大面积心肌梗死(P<0.05),而I/R+CS组的射血分数和缩短分数均较I/R组显著升高,心肌梗死面积较I/R组显著降低(P<0.05)。与假手术组相比,I/R组心肌组织中IC3-II、LC3-I、Becl-1和P62、p-p38/p38、p-JNK/JNK表达显著上调(均P<0.05),而TRPN、Atg5和Rab 7表达显著降低(均P<0.05);与I/R组相比,I/R+CS组的TRPV1、LC3-II/LC3-I、Atg5、Beclin-1、Rab 7蛋白表达显著上调(均P<0.05),P62、p-p38/p38、p-JNK/JNK的表达显著降低(均P<0.05)。与Con组相比,H/R组自噬体和自噬溶酶体均显著增加(P<0.05)。与H/R组相比,H/R+CS组自噬体显著增加(P<0.05)。此外,H/R+CS+Anisomycin组自噬体较H/R+CS组显著减少(P<0.05)。结论Capsaicin可以通过MAPK信号通路增强自噬通量以减轻心肌I/R损伤,这为TRPV1的心脏保护作用提供了新的见解。

TRPV1介导H4组蛋白乳酸化调控AD炎症激活小胶质细胞

目的:阿尔茨海默病(AD)中小胶质细胞的免疫监测和吞噬功能逐渐减弱并发生炎症激活。以往研究报道瞬时受体电位香草素1型(TRPV1)通道的激活可以缓解3xTg小鼠脑内小胶质细胞的炎症激活和吞噬功能障碍,作用机制尚不清楚。方法:首先,通过蛋白印迹法和免疫荧光实验测量3xTg小鼠大脑细胞核内组蛋白H4的12位赖氨酸乳酸化(H4K12la)的表达水平和细胞定位情况。其次,验证TRPV1的激活是否可以调控3xTg小鼠大脑细胞核内H4K12la的表达水平。最后,使用Imaris软件和流式细胞术分析TRPV1的激活对小胶质细胞炎症激活形态和生物标志物的影响。结果:蛋白印迹法显示3xTg小鼠大脑细胞核内H4K12la的表达水平上升,免疫荧光实验证明H4K12la与小胶质细胞共定位。TRPV1的激活可以减少3xTg小鼠脑内小胶质细胞中H4K12la的表达水平,缓解3xTg小鼠脑内小胶质细胞炎症激活。结论:TRPV1可以通过抑制组蛋白H4K12la表达缓解AD小胶质细胞炎症激活。

小檗碱对高糖培养的背根神经节中疼痛相关因子的影响

目的探讨小檗碱对痛性糖尿病神经病变疼痛相关蛋白P2X3、TRPV4、神经型一氧化氮合酶(nNOS)表达的影响及意义。方法新生大鼠离体培养背根神经节神经元,免疫组织化学法、蛋白质印迹法检测细胞表达阳性率及蛋白表达。结果 P2X3、TRPV4、nNOS正常条件下在背根神经节中均有表达。免疫组织化学法检测高糖培养条件下P2X3、TRPV4、nNOS可看到阳性表达神经元增多,受体表达升高。小檗碱处理后,P2X3、TRPV4、nNOS表达均下降。蛋白质印迹法检测结果显示高糖条件下P2X3、nNOS表达高于对照组(P<0.01),小檗碱处理后,P2X3、TRPV4、nNOS均较高糖组降低(P<0.01,P<0.05,P<0.01)。结论小檗碱可降低背根神经节神经元高糖环境下P2X3、TRPV4、nNOS的高表达,对糖尿病受损神经元有保护作用,可能为改善痛性糖尿病神经病变提供新途径。

牛蒡子苷元基于机械敏感离子通道对软骨细胞转录因子和胶原蛋白表达的影响

目的:基于机械敏感离子通道探讨牛蒡子苷元(ARG)对软骨细胞SRY相关高迁移率族盒蛋白转录因子9(SOX9)、Runt相关转录因子2(RUNX2)和胶原蛋白表达的影响。方法:分离并培养原代小鼠软骨细胞。将细胞分为空白组(常规培养基)、ARG组(10μmol/L)、瞬时受体电位香草素亚家族4(TRPV4)抑制剂组(GSK2193874,10 nmol/L)、ARG+抑制剂组(10μmol/L ARG+10 nmol/L GSK2193874)和TRPV4激动剂组(GSK1016790A,10 nmol/L),各组给予相应干预。细胞培养24 h后,免疫荧光染色检测Ⅱ型胶原蛋白(ColⅡ)表达,PCR检测Ⅰ型胶原蛋白(ColⅠ)和ColⅡ的mRNA表达水平,Western blot检测转录因子SOX9、RUNX2及ColⅠ、ColⅡ的蛋白表达水平。结果:①免疫荧光染色观察显示,与空白组相比,ARG组、抑制剂组和ARG+抑制剂组ColⅡ蛋白表达更显著,而激动剂组较弱。与ARG组或抑制剂组相比,ARG+抑制剂组ColⅡ蛋白表达更显著。②与空白组相比,ARG组、抑制剂组和ARG+抑制剂组ColⅡmRNA表达量显著增高(P<0.05,P<0.01),ColⅠmRNA表达量明显降低(P<0.01),而激动剂组ColⅡmRNA表达量显著降低(P<0.01)。与ARG组相比,抑制剂组和ARG+抑制剂组细胞的ColⅡ和ColⅠ的mRNA表达量均显著增高(P<0.05,P<0.01),而激动剂组ColⅠmRNA表达量增高(P<0.01),ColⅡmRNA表达量降低(P<0.01)。与抑制剂组相比,ARG+抑制剂组ColⅡ和ColⅠ的mRNA表达量均显著增高(P<0.05)。③与空白组相比,ARG组ColⅡ蛋白表达量显著上调(P<0.01),ColⅠ、SOX9和RUNX2蛋白表达量降低(P<0.05,P<0.01);抑制剂组ColⅡ蛋白表达量亦明显增多(P<0.01),ColⅠ和RUNX2蛋白表达量明显降低(P<0.01);ARG+抑制剂组细胞的ColⅡ蛋白表达量显著升高(P<0.01),SOX9蛋白表达量显著降低(P<0.05),ColⅠ和RUNX2蛋白表达无明显变化(P>0.05);激动剂组ColⅡ和SOX9蛋白表达量明显降低(P<0.01),RUNX2蛋白表达量明显增高(P<0.01),ColⅠ蛋白表达量无明显变化(P>0.05)。④与ARG组相比,抑制剂组ColⅡ和ColⅠ蛋白表达量均显著增高(P<0.05,P<0.01);ARG+抑制剂组细胞的ColⅡ、ColⅠ和RUNX2蛋白表达量均明显增高(P<0.01);激动剂组ColⅡ蛋白表达量降低(P<0.01),ColⅠ和RUNX2蛋白表达量升高(P<0.01)。与抑制剂组相比,ARG+抑制剂组细胞的ColⅡ、ColⅠ和RUNX2蛋白表达量均显著增多(P<0.05),SOX9蛋白表达量明显降低(P<0.05)。结论:ARG可上调软骨细胞ColⅡ表达,抑制ColⅠ表达,调节转录因子SOX9和RUNX2,促进软骨细胞分化成熟。其作用与TRPV4抑制剂相似,两者合用对ColⅡ的调控作用更显著。

TRPV4在骨关节炎与正常软骨中的表达差异及意义

目的探索瞬时受体电位香草素受体4型通道蛋白(transient receptor potential vanilloid receptor 4,TRPV4)在骨关节炎(osteoarthritis,OA)软骨与正常软骨中的表达差异,为进一步研究其在OA防治中的作用提供理论依据。方法取膝关节OA患者软骨组织(OA组)与股骨颈骨折患者正常软骨组织(对照组)。其中,OA组男6例,女9例;年龄55~78岁,平均69岁;Kellgren-Lawrence(K-L)评分为(3.0±0.8)分。对照组男5例,女10例;年龄57~91岁,平均71岁。两组患者性别及年龄比较差异无统计学意义(P>0.05)。采用Western blot、实时荧光定量PCR、Masson染色以及免疫组织化学染色,观察并比较两组软骨组织中TRPV4蛋白及mRNA表达差异,以及软骨组织退变程度;分析OA组患者K-L评分与TRPV4阳性细胞率的相关性。结果OA组TRPV4蛋白及mRNA相对表达量分别为0.454±0.199、2.951±1.200,高于对照组的0.165±0.074、1.437±0.682,其中蛋白相对表达量组间差异有统计学意义(t=2.718,P=0.026)。组织染色显示,OA组软骨细胞排列紊乱,细胞外基质失去正常结构,局部软骨缺损可达深层,退变组织中可见较多TRPV4阳性细胞,阳性细胞率为37.353%±13.496%;对照组软骨细胞层次分明,阳性细胞率仅为9.642%±3.284%;两组阳性细胞率比较差异有统计学意义(t=7.491,P=0.000)。OA组TRPV4阳性细胞率与OA的K-L评分成正相关(r=0.775,P=0.001)。结论TRPV4在OA软骨组织中表达升高,且其表达升高与OA进展有相关性。

辣椒素抑制血管紧张素Ⅱ介导的血管收缩

目的观察长期应用辣椒素作为瞬时受体电位通道香草醛类受体1型(TRPV1)激动剂对C57BL/6J小鼠胸主动脉收缩功能的作用。方法2月龄的雄性C57BL/6J小鼠,完全随机分为:普通饲料组(普食组,n=12)和普通饲料+辣椒素组(辣椒素组,n=12)。干预开始及结束时测鼠尾动脉收缩压;喂养6月后,颈动脉插管测颈动脉血压及心率。取小鼠胸主动脉,利用体外血管环张力测定技术,检测其对氯化钾(KCl)、血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)、苯肾上腺素(PE)的收缩反应。采血测血浆肾素、AngⅡ、醛固酮浓度。培养C57BL/6J小鼠胸主动脉血管平滑肌细胞(VSMC),辣椒素(1μmol/L)孵育24 h后,应用Western-blot法检测VSMC的AngⅡ1型受体(AT1R)的表达,应用比率荧光成像系统测定AngⅡ(1μmol)对细胞内游离钙浓度的影响。结果6月后,两组间鼠尾动脉收缩压和颈动脉平均动脉压及心率无显著性差异。两组间胸主动脉对PE诱导的收缩反应无显著性差异;辣椒素组胸主动脉对AngⅡ诱导的收缩反应[(37.5±1.6)%]明显低于普食组[(59.8±1.4)%,P<0.05]。两组间血浆肾素、AngⅡ、醛固酮浓度无显著差异。培养的VSMC,辣椒素干预后AT1R蛋白表达仅为普食组的(62.4±16.6)%(P<0.05)。辣椒素组AngⅡ诱导的细胞内游离钙浓度(0.91±0.12)增加低于对照组(1.37±0.35,P<0.05)。结论应用辣椒素激活TRPV1受体能有效抑制动脉血管对AngⅡ的收缩反应,其机制与下调AT1R的表达,降低AngⅡ诱导的细胞内游离钙增加有关。