抑制瞬时感受器电位香草素受体亚家族Ⅳ型通道对大鼠视网膜缺血-再灌注损伤后细胞凋亡与新生血管生成的作用

目的探讨抑制瞬时感受器电位香草素受体亚家族Ⅳ型(TRPV4)通道对大鼠视网膜缺血-再灌注损伤(RIRI)细胞凋亡和血管形成的影响。方法将30只SD大鼠分为对照组、RIRI组和RIRI+HC-067047组,每组10只。采用高眼压法建立大鼠RIRI模型,RIRI+HC-067047组在造模后5、10 h通过侧脑室注射HC-067047(5μmol/μL),对照组和RIRI组给予同等剂量的生理盐水。测量各组大鼠治疗后第7天、第14天与第21天的体质量,于治疗第21天观察大鼠视网膜组织形态变化和视网膜组织神经细胞凋亡情况,检测各组大鼠视网膜组织半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(Caspase-3)、血管内皮生长因子(VEGF)蛋白阳性表达情况,VEGF、核因子E2相关因子2(Nrf2)、缺氧诱导因子1α(HIF-1α)mRNA的相对表达水平,以及色素上皮衍生因子(PEDF)、胶质纤维酸性蛋白质(GFAP)、Caspase-3、B细胞淋巴瘤-2(Bcl-2)及Bcl-2相关X蛋白(Bax)的相对表达水平。结果与对照组比较,治疗后第21天RIRI组大鼠体质量下降,RIRI组和RIRI+HC-067047组视网膜组织神经细胞凋亡增加,Caspase-3、VEGF蛋白阳性表达率增加,Nrf2、VEGF、HIF-1αmRNA相对表达水平升高,PEDF、Bcl-2蛋白表达水平下降而GFAP、Caspase-3、Bax蛋白表达水平升高(均P<0.05)。与RIRI组比较,治疗后第21天,RIRI+HC-067047组视网膜神经细胞凋亡数目减少,Caspase-3、VEGF蛋白阳性表达率下降,Nrf2、VEGF、HIF-1αmRNA相对表达水平下降,PEDF、Bcl-2蛋白表达水平升高而GFAP、Caspase-3、Bax蛋白表达水平下降(均P<0.05)。结论抑制TRPV4通道可改善大鼠RIRI,其机制可能与抑制视网膜细胞凋亡与减少血管新生有关。

瞬时感受器电位香草素受体亚家族Ⅳ型抑制剂HC067047对脂多糖诱导的小鼠焦虑样行为的影响

目的探讨瞬时感受器电位香草素受体亚家族Ⅳ型(TRPV4)抑制剂HC067047对脂多糖(LPS)模型小鼠焦虑样行为的影响。方法48只雄性C57BL/6小鼠随机分为对照组(NS)、模型组(LPS)和药物干预组(HC+LPS)。腹腔注射0.83 mg/kg LPS建立焦虑样小鼠模型,HC+LPS组于LPS注射前30 min腹腔注射HC067047(10 mg/kg),NS组及LPS组注射等体积溶媒;旷场实验以及社会交往实验观察小鼠焦虑样行为;免疫组织化学及Western blotting检测海马TRPV4、诱导型一氧化氮合酶(iNOS)、神经型一氧化氮合酶(nNOS)和内皮型一氧化氮合酶(eNOS)的表达情况。结果免疫组织化学和Western blotting实验发现,与NS组相比,LPS组小鼠海马中TRPV4表达显著上调(P<0.0001);旷场实验中,与NS组比较,发现LPS组小鼠活动的总距离(P<0.0001)、在中央区域活动的距离(P<0.01)以及在中央区域活动的时间均明显减少(P<0.01),HC067047干预可增加LPS模型小鼠的活动总距离(P<0.05)、在中央区域活动的距离(P<0.001)以及在中央区域的活动时间(P<0.01);社会交往实验中,与NS组相比,LPS组小鼠与陌生小鼠的交往时间显著降低(P<0.01),HC067047干预后能显著增加LPS模型小鼠与陌生小鼠的交往时间(P<0.01);Western blotting检测发现,LPS组小鼠海马中iNOS(P<0.05)、nNOS(P<0.001)和eNOS(P<0.001)的表达显著高于NS组,但HC067047干预后可使LPS模型小鼠海马中iNOS(P<0.05)、nNOS(P<0.01)、eNOS(P<0.01)的表达明显降低。结论抑制TRPV4的表达能够改善LPS所致小鼠焦虑样行为,该过程可能与抗氧化应激有关。

香草素受体4型瞬时感受器电位通道及其抑制剂与相关呼吸系统疾病关系的研究进展

香草素受体4型瞬时感受器电位(TRPV4)通道是瞬时感受器电位通道家族成员之一,是一种对钙离子具有选择通透性的阳离子通道。该通道激活后可引起胞内钙离子浓度升高,进而参与调节机体多种生理或病理过程。近年来大量文献表明,TRPV4通道可能与多种呼吸系统疾病的发病机制有关,包括急性肺损伤、慢性阻塞性肺疾病、肺动脉高压、特发性肺纤维化和哮喘等,TRPV4抑制剂的应用可不同程度地缓解上述疾病进展。本文对TRPV4通道及其抑制剂与有关呼吸系统疾病关系的研究进展予以综述。

基于瞬时受体电位香草素亚家族4信号通路探讨牛蒡子苷元对体外培养软骨细胞增殖及Ⅱ型胶原蛋白和软骨蛋白聚糖表达的影响

目的:基于瞬时受体电位香草素亚家族4(transient receptor potential vanilloid 4,TRPV4)信号通路探讨牛蒡子苷元对体外培养软骨细胞增殖及Ⅱ型胶原蛋白和软骨蛋白聚糖表达的影响。方法:自新生SD大鼠膝关节软骨组织提取软骨细胞,进行体外培养,取第1代软骨细胞分别加入不同培养液进行干预。空白组仅加入常规培养液,牛蒡子苷元组加入含10μmol牛蒡子苷元的培养液,牛蒡子苷元联合阻断剂组加入含10μmol牛蒡子苷元和10μmol GSK205的培养液,激动剂组加入含1μmol 4α-PPD的培养液,阻断剂联合激动剂组加入含10μmol GSK205和1μmol 4α-PPD的培养液,阻断剂组加入含10μmol GSK205的培养液。分别于干预24 h和72 h后以CCK-8法检测软骨细胞增殖情况,48 h后以Western blot法检测软骨蛋白聚糖和Ⅱ型胶原蛋白水平。结果:(1)软骨细胞增殖测定结果。干预24 h后,6组的吸光度比较,差异有统计学意义(1.03±0.72,1.32±0.11,1.01±0.05,1.33±0.34,1.04±0.50,1.10±0.06;F=18.309,P=0.000)。牛蒡子苷元组、激动剂组的吸光度均高于空白组(P=0.000,P=0.000);牛蒡子苷元联合阻断剂组、阻断剂联合激动剂组、阻断剂组的吸光度与空白组比较,组间差异均无统计学意义(P=0.632,P=0.840,P=0.164);牛蒡子苷元组的吸光度高于牛蒡子苷元联合阻断剂组、阻断剂联合激动剂组(P=0.000,P=0.000);牛蒡子苷元组与激动剂组比较,差异无统计学意义(P=0.834);牛蒡子苷元联合阻断剂组的吸光度低于激动剂组(P=0.000),与阻断剂联合激动剂组比较,差异无统计学意义(P=0.498);激动剂组的吸光度高于阻断剂联合激动剂组(P=0.000)。干预72 h后,6组的吸光度比较,差异有统计学意义(1.66±0.02,2.21±0.05,1.84±0.04,1.92±0.07,1.71±0.10,1.74±0.08;F=37.629,P=0.000)。牛蒡子苷元组、牛蒡子苷元联合阻断剂组、激动剂组的吸光度均高于空白组(P=0.000,P=0.001,P=0.000);阻断剂联合激动剂组、阻断剂组与空白组比较,组间差异均无统计学意义(P=0.326,P=0.104);牛蒡子苷元组的吸光度高于牛蒡子苷元联合阻断剂组、激动剂组及阻断剂联合激动剂组(P=0.000,P=0.000,P=0.000);牛蒡子苷元联合阻断剂组的吸光度低于激动剂组(P=0.010),与阻断剂联合激动剂组比较,差异无统计学意义(P=0.098);激动剂组的吸光度高于阻断剂联合激动剂组(P=0.000)。(2)软骨蛋白聚糖和Ⅱ型胶原蛋白水平测定结果。5组软骨细胞中软骨蛋白聚糖水平比较,差异有统计学意义(1.00±0.00,20.74±5.01,4.20±0.66,22.87±1.82,2.09±0.63;F=194.544,P=0.000)。牛蒡子苷元组、激动剂组的软骨蛋白聚糖水平均高于空白组(P=0.000,P=0.000);牛蒡子苷元联合阻断剂组、阻断剂联合激动剂组与空白组比较,组间差异均无统计学意义(P=0.136,P=0.593);牛蒡子苷元组的软骨蛋白聚糖水平高于牛蒡子苷元联合阻断剂组、阻断剂联合激动剂组(P=0.000,P=0.000);牛蒡子苷元组与激动剂组比较,差异无统计学意义(P=0.305);牛蒡子苷元联合阻断剂组的软骨蛋白聚糖水平低于激动剂组(P=0.000),与阻断剂联合激动剂组比较,差异无统计学意义(P=0.310);激动剂组的软骨蛋白聚糖水平高于阻断剂联合激动剂组(P=0.000)。5组软骨细胞中Ⅱ型胶原蛋白水平比较,差异有统计学意义(1.00±0.00,2.94±0.11,1.92±0.17,2.04±0.12,0.78±0.09;F=58.701,P=0.000)。牛蒡子苷元组、牛蒡子苷元联合阻断剂组、激动剂组的Ⅱ型胶原蛋白水平均高于空白组(P=0.000,P=0.000,P=0.000);阻断剂联合激动剂组的Ⅱ型胶原蛋白水平低于空白组(P=0.032);牛蒡子苷元组的Ⅱ型胶原蛋白水平高于牛蒡子苷元联合阻断剂组、激动剂组、阻断剂联合激动剂组(P=0.000,P=0.000,P=0.000);牛蒡子苷元联合阻断剂组的Ⅱ型胶原蛋白水平高于阻断剂联合激动剂组(P=0.000),与激动剂组比较,差异无统计学意义(P=0.193);激动剂组的Ⅱ型胶原蛋白水平高于阻断剂联合激动剂组(P=0.000)。结论:牛蒡子苷元可通过TRPV4信号通路促进体外培养软骨细胞的增殖及软骨细胞中Ⅱ型胶原蛋白和软骨蛋白聚糖的表达。

瞬时感受器电位离子通道香草素受体亚家族在低氧条件下肺动脉平滑肌细胞中的表达

瞬时感受器电位离子通道香草素受体亚家族（transientreceptorpotentialvanilloid．related，TRPV）即TRPV家族，是近年来备受关注的TRP超家族成员，具有6个亚型，是非选择性阳离子通道，该通道的激活可诱发细胞钙内流，进而诱发生理及疾病状态下呼吸系统的功能调节，TRPV通道在肺动脉平滑肌细胞（pulmonaryarterysmoothmusclecell，PASMC）的研究目前还处于全新领域。

青蒿素对氧化低密度脂蛋白诱导的血管内皮细胞损伤的作用及机制

目的探讨青蒿素(ART)对氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)诱导的血管内皮细胞损伤的作用及其潜在的分子机制。方法分别用0、50、100、150、200 mg/ml的ox-LDL及0、1、5、10、20 mmol/L的ART处理对数生长期的人脐静脉内皮细胞EA.hy926,采用MTT法检测细胞活性。为检测ART对细胞的影响,将EA.hy926细胞分为4组:对照组(无处理)、ox-LDL组(100 mg/ml ox-LDL)、ox-LDL+ART组(100 mg/ml ox-LDL+10 mmol/L ART)及ox-LDL+ART+3-甲基腺嘌呤(3-MA)组(100 mg/ml ox-LDL+10 mmol/L ART+5 mmol/L 3-MA);为检测瞬时感受器电位通道香草酸受体亚型Ⅳ(TRPV4)对细胞的影响,将EA.hy926细胞分为4组:对照组、ox-LDL组、ox-LDL+ART组及ox-LDL+ART+钌红(RR)组(100 mg/ml ox-LDL+10 mmol/L ART+10 mmol/L RR)。采用MTT法检测细胞活性,Western blotting检测TRPV4、自噬相关蛋白(LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、p62)及凋亡相关蛋白(Bcl-2、Bax)的表达,流式细胞仪检测细胞凋亡情况。结果EA.hy926细胞活性随着ox-LDL浓度的升高而降低,而ART作用于ox-LDL诱导的细胞后,细胞活性明显升高(P<0.05)。与对照组比较,ox-LDL组细胞活性,p62、Bcl-2、TRPV4表达水平明显降低,而LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值、细胞凋亡率、Bax表达水平明显升高,差异均有统计学意义(P<0.05)。与ox-LDL组比较,ox-LDL+ART组细胞活性、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值、Bcl-2及TRPV4表达水平明显升高,而细胞凋亡率、Bax及p62表达水平明显降低,差异均有统计学意义(P<0.05)。与ox-LDL+ART组比较,ox-LDL+ART+3-MA组及ox-LDL+ART+RR组细胞活性、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值、Bcl-2表达水平明显降低,细胞凋亡率、p62及Bax表达水平明显升高,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论ART可通过激活TRPV4促进细胞自噬,从而减轻ox-LDL诱导的血管内皮细胞损伤。

TRPV4活化调控炎性小体Nod样受体家族3在小鼠膀胱上皮细胞损伤中作用和机制研究

目的探讨瞬时受体电位离子通道香草素受体亚家族4(transient receptor potential vanilloid receptor 4, TRPV4)通道活化在小鼠原代培养的膀胱上皮细胞损伤中的作用及其分子机制。方法小鼠1只,原代培养膀胱上皮细胞,并分为对照组、刺激组、β-羟基丁酸(β-hydroxybutyrate, BHB)预处理组和细胞因子释放抑制药物3(cytokine release inhibitory drug 3, MCC950)预处理组,刺激组采用TRPV4激动剂GSK1016790A 100μmol/L进行刺激;BHB预处理组和MCC950预处理组分别给予10 mmol/L BHB和50μmol/L MCC950后采用TRPV4激动剂GSK1016790A进行刺激;对照组正常培养。4组细胞采用Calcein-AM/PI双染色法观察活细胞数和死细胞数;采用乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase, LDH)细胞毒实验检测细胞LDH水平;采用Western blot法检测刺激组GSK1016790A刺激前及刺激3、6、9 h时细胞Nod样受体家族含pyrin结构域蛋白3(Nod-like receptor family pyrin domain-containing protein 3, NLRP3)及其下游活化产物胱冬肽酶-1(caspase-1 p10)相对表达量。结果刺激组Calcein-AM染色的活细胞数[(46.80±15.51)个]较对照组[(1 242.20±143.79)个]、BHB预处理组[(1 001.20±115.41)个]和MCC950预处理组[(1 144.00±138.62)个]减少(P<0.05),BHB预处理组、MCC950预处理组少于对照组(P<0.05),BHB预处理组与MCC950预处理组比较差异无统计学意义(P>0.05);刺激组PI染色的死细胞数[(1 111.60±127.49)个]较对照组[(33.80±8.41)个]、BHB预处理组[(251.80±48.67)个]和MCC950预处理组[(265.20±31.57)个]增多(P<0.05),BHB预处理组、MCC950预处理组多于对照组(P<0.05),BHB预处理组与MCC950预处理组比较差异无统计学意义(P>0.05);刺激组LDH水平[(85.27±7.18)u/L]高于对照组[(22.47±2.94)u/L]、BHB预处理组[(35.74±4.32)u/L]和MCC950预处理组[(37.09±4.09)u/L](P<0.05),BHB预处理组、MCC950预处理组高于对照组(P<0.05),BHB预处理组与MCC950预处理组比较差异无统计学意义(P>0.05);刺激组GSK1016790A刺激3、6、9 h时细胞中NLRP3(0.68±0.07、0.86±0.08、0.79±0.09)、caspase-1 p10表达量(0.68±0.06、0.51±0.07、0.47±0.05)均高于刺激前(0.36±0.05、0.24±0.06)(P<0.05)。结论 TRPV4可通过活化炎性小体NLRP3导致小鼠膀胱上皮细胞损伤,调控TRPV4-NLRP3可能为膀胱过度活动症治疗提供新靶点。

TRPV4在皮肤免疫性大疱病中的表达及意义

目的探讨TRPV4蛋白在寻常型天疱疮(PV)、大疱性类天疱疮(BP)、疱疹样皮炎(DH)、获得性大疱性表皮松解症(EBA)中的作用机制。方法用免疫组化方法检测正常皮肤组织、PV、BP、DH及EBA皮损组织中TRPV4蛋白的表达量。结果 TRPV4在PV(61.90%)、BP(81.81%)、DH(72.22%)、EBA(68.42%)的阳性率均低于正常皮肤组织(93.33%),且各类疾病间亦存在表达差异(PV<EBA<DH<BP)。结论 TRPV4蛋白的低表达可能影响着皮肤连接的形成或修复,参与皮肤免疫性大疱病的发生、发展。

TRPV3通道研究进展

瞬时受体电位离子通道香草素亚家族3(transient receptor potential vanilloid 3,TRPV3)是位于细胞膜上的一种非选择性阳离子通道蛋白,广泛表达于皮肤、大脑、背根神经节、心脏和结肠等器官。TRPV3参与感觉传导、皮肤屏障形成、毛发生长及血管舒张等生理过程,并被证明与瘙痒、皮肤炎症性疾病及癌症等病理进程密切相关。TRPV3能应答非伤害性热刺激(≥33℃)、内源性物质(如焦磷酸法尼酯)及外源性小分子化合物(如香芹酚、樟脑和2-APB等)。近年来,多种天然和合成的TRPV3抑制剂(如蛇床子素、74a和达克罗宁等)陆续被发现,并且在多种疾病动物模型中表现出一定疗效,说明TRPV3是具有潜力的药物开发靶点。本文综述了TRPV3通道蛋白结构、生理功能、相关疾病及调节剂的研究进展,为TRPV3的后续研究提供理论参考。

野黄芩素类似物的设计合成与活性评价

目的合成野黄芩素类似物并对其进行溶解性与生物活性研究。方法基于先导化合物野黄芩素,通过官能团修饰、电子等排原理、母核开环进行结构设计并合成了12个化合物,通过氢核磁共振(1H nuclear magnetic resonance,1H-NMR)、碳核磁共振(13C nuclear magnetic resonance,13C-NMR)和质谱(mass spectrometry,MS)对化合物结构进行表征;测定化合物溶解度并通过钙流检测评价所有化合物对瞬时受体电位离子通道香草素亚家族3(transient receptor potential vanilloid 3,TRPV3)的抑制活性;通过建立咪喹莫特(IMQ)诱导银屑病动物模型,选择3种最具潜力的化合物进行的抗银屑病实验。结果所有化合物溶解度均高于野黄芩素。在钙流实验中,化合物I-01,I-04,I-06显示出较强的TRPV3抑制作用,均优于YHQ,其中,I-06活性最强。银屑病动物实验显示I-06可显著改善银屑病小鼠的病理外观,降低炎症因子IL-6与TNF-α水平,I-06抗银屑病活性最佳,优于I-01、I-04。结论该类野黄芩素类似物对银屑病具有潜在的治疗价值,同时,为靶向TRPV3治疗各种皮肤疾病提供了一个新的思路。

TRPV4活化调控TXNIP表达在急性大鼠肾损伤中的作用及分子机制

目的观察TRPV4通道活化是否诱导大鼠肾小管上皮细胞(NRK-52E)损伤,并探讨可能的分子机制。方法利用不同浓度的TRPV4激动剂4α-PDD刺激NRK-52E细胞,应用Calcein-AM/PI双染色和LDH释放实验检测NRK-52E细胞损伤情况。Western blot检测TXNIP的表达,siRNA沉默TXNIP表达对4α-PDD诱导的NRK细胞损伤的影响。结果 4α-PDD诱导NRK-52E细胞损伤,表现为Calcein-AM染色的活细胞数下降,PI染色的死细胞增加,同时LDH释放增加,且这种损伤作用呈时间和剂量依赖。4α-PDD诱导TXNIP表达,且表达呈时间和剂量依赖。利用siRNA沉默表达TXNIP可明显降低TRPV4活化导致的NRK-52E损伤。结论 TRPV4活化通过上调TXNIP的表达导致NRK细胞的损伤,通过调控TRPV4/TXNIP很可能为保护肾损伤提供新的理论依据。

臭氧在大鼠神经病理性疼痛治疗中对TRPV4的影响

目的通过观察大鼠瞬时感受器电位离子通道香草素受体亚家族4(TRPV4)的变化,进一步探讨臭氧治疗神经病理性疼痛的作用机制。方法健康雌性SD大鼠72只,体重150~180 g,3~4月龄,采用随机数字表法将其随机分为3组(n=24):对照组(C组),仅暴露坐骨神经;神经病理性疼痛组(NP组),结扎右侧坐骨神经;臭氧注射组(CY组),结扎右侧坐骨神经,大鼠右后肢出现跛行、缩足等症状后局部注射35μg/ml臭氧0.5 ml,连续注射7 d。于制模前,制模后1、3、5、7 d及注射臭氧后3、5、7 d测定大鼠术侧足底机械缩足反应阈值(MWT)。分别于注射臭氧后3、5、7 d处死8只大鼠,采用免疫组织化学和RT-PCR方法测定背根神经节TRPV4的阳性细胞数与mRNA表达水平。结果与C组比较,NP组和CY组制模后各时点MWT较低,TRPV4阳性细胞计数较高,TRPV4的mRNA均上调(P均<0.05);与NP组比较,CY组制模后各时点MWT较高,TRPV4阳性细胞计数较低,TRPV4的mRNA均上调(P均<0.05)。结论臭氧可能通过介导TRPV4的表达,对神经病理性疼痛发挥镇痛作用。

模拟步行压力下牛蒡子苷元对软骨细胞的保护机制研究

目的:探讨模拟步行压力对软骨细胞的作用及压力负荷下牛蒡子苷元(ARG)对软骨细胞Ⅱ型胶原蛋白(ColⅡ)、SRY相关高迁移率族盒蛋白转录因子9(SOX9)、瞬时受体电位香草素亚家族4(TRPV4)、基质金属蛋白酶(MMPs)的影响。方法:分离并培养小鼠原代软骨细胞,制备3D培养软骨细胞水凝胶。将制备的水凝胶分为空白组、模型组、ARG组和抑制剂组。空白组不进行压力干预,使用常规培养基换液。其他3组均给予模拟步行压力(正弦波,1 Hz,20 kPa)干预2 h。压力干预同时,ARG组和抑制剂组分别给予10μmol/L ARG和10 nmol/L TRPV4抑制剂GSK2193874。收集干预后各组水凝胶提取的软骨细胞,免疫荧光染色检测ColⅡ蛋白表达,PCR检测ColⅡ、SOX9、TRPV4、MMP9、MMP13的mRNA表达水平,Western blot检测ColⅡ、SOX9、TRPV4的蛋白表达水平。结果:①免疫荧光染色观察显示,与空白组相比,模型组ColⅡ蛋白表达较少;与模型组相比,ARG组和抑制剂组ColⅡ蛋白表达明显增多。②与空白组相比,模型组ColⅡ、SOX9、TRPV4的mRNA表达量显著降低(P<0.01),MMP9和MMP13的mRNA表达量均显著增高(P<0.01);与模型组相比,ARG组和抑制剂组ColⅡ、SOX9、TRPV4的mRNA表达量显著增高(P<0.01),MMP9和MMP13的mRNA表达量均显著降低(P<0.01)。③与空白组相比,模型组ColⅡ和SOX9蛋白表达水平显著降低(P<0.01),TRPV4蛋白表达无明显变化;与模型组相比,ARG组和抑制剂组ColⅡ和SOX9蛋白表达水平显著增高(P<0.01),TRPV4蛋白表达水平显著降低(P<0.01)。结论:模拟步行压力可导致软骨细胞发生趋向于软骨退化的代谢反应。模拟步行压力下,ARG和TRPV4抑制剂对软骨细胞具有保护作用,其机制可能与上调ColⅡ、SOX9表达,抑制TRPV4、MMP9和MMP13的表达有关。