小麦连体叶片高效瞬时表达体系的构建

分别以洋葱表皮和生长7d的小麦连体叶片为材料,采用HeliosTM基因枪将35S-sGFP-TYG-NOS(pUC19)外源基因导入植物细胞使其瞬时表达,摸索出一整套适合于小麦连体叶片高效瞬时表达体系的各项参数,包括:氦气压力、金粒子直径、PVP浓度、每次轰击的质粒DNA以及金粉用量等。并指出选用合适的质粒DNA浓度和多片小麦叶片同时轰击可有效提高转化效率。

浮萍原生质体瞬时表达体系的建立及其应用研究

【目的】建立浮萍原生质体瞬时表达体系,以加快浮萍生物反应器工程的开发进程。【方法】采用酶解法制备浮萍原生质体,通过对愈伤组织类型、渗透压、预处理方法等一系列参数的优化调整,建立了浮萍原生质体制备方法。利用农杆菌介导外源基因进入浮萍愈伤组织,并制备原生质体观察瞬时表达情况,通过对农杆菌种类、菌浓度、乙酰丁香酮浓度及共培养时间等参数进行调整,筛选最佳的浸染条件。最后利用该瞬时表达体系进行亚细胞定位研究和启动子功能验证。【结果】原生质体制备的最佳条件为:以4℃过夜培养的浮萍悬浮培养愈伤组织为制备材料,用酶液(2%纤维素酶、0.5%离析酶、0.5%果胶酶、0.1 mol/L CaCl2、0.2 mol/L KCl、1%BSA、20 mmol/L MES pH 5.8、0.5 mol/L甘露醇)于25℃避光消化16 h(40 r/min);农杆菌浸染最佳条件为:农杆菌GV301在菌浓度(OD600)为1、乙酰丁香酮浓度为100μmol/L时,浸染悬浮培养愈伤有最大转化率。【结论】成功建立了浮萍原生质体瞬时表达体系,并证明其可用于亚细胞定位和启动子功能验证等方面的研究。

植物microRNA功能瞬时验证体系的建立

目的:建立植物microRNA(miRNA)功能的瞬时活体验证体系,并检验该体系的有效性。方法:选用双元表达载体pCAMBIA1200,并插入烟草花叶病毒双35S启动子,以驱动目标miRNA超表达;选用双元表达载体pFGC5941的绿色荧光蛋白(GFP)改造载体用于潜在的靶基因与GFP融合蛋白的超表达,以转入这2种载体的农杆菌侵染烟草叶片,观察GFP融合蛋白的荧光,作为验证miRNA对其潜在靶基因调控作用的瞬时验证体系。选取拟南芥已知功能的miR393及其靶基因AFB3,分别构建pCAMBIA1200-35S-miR393和pFGC5941-GFP-AFB3载体,利用农杆菌注射烟草叶片进行2个载体共转化,并以pFGC5941-GFP-AFB3单转化作为对照,激光共聚焦显微镜下观察融合蛋白的表达。结果:只将AFB3导入烟草表皮细胞,可观察到绿色荧光;而将miR393与AFB3同时导入烟草表皮细胞后,未能观察到绿色荧光。表明miR393抑制了AFB3的表达。结论:本瞬时表达体系可作为植物miRNA功能的活体瞬时验证体系,为miRNA调控靶基因表达功能提供简单、快速、有效的证据。

植物原生质体在分子细胞生物学研究中的应用

植物原生质体以之全能性的优势被广泛运用于分子细胞生物学研究中,包括亚细胞定位检测、融合培育、瞬时表达体系建立、植物病毒粒体形态特征检测中的运用。本文将对植物原生质体在分子细胞生物学研究中的应用以及优势与缺陷进行综述。引言原生质体最早在1880年被提出,植物原生质体是指通过酶解或机械法的作用将植物细胞进行质壁分离后获得的细胞质。植物原生质体具有全套的遗传物质,具有细胞壁再生并能进行人工培养分化发育成完整植株的能力。植物原生质体由于取出了细胞壁,通过采用外源添加物以及外源基因的处理后,能够快速产生反应、代谢以及反馈,被广泛运用于植物分子细胞生物学研究中,能够提高实验效率,并获得有效的体内实验相关数据。

真菌免疫调节蛋白FIP在烟草中的瞬时表达

当短时间内需要高水平的基因表达时,采用病毒载体介导的植物瞬时表达系统是具有一定优势的。本研究中我们构建了植物瞬时表达载体p35S-30B-FIP,并将表达载体转化农杆菌EHA105,建立了植物瞬时表达体系。利用一种瞬时表达体系的新型农杆菌侵染技术(根部真空侵染法)在烟草(Nicotiana tabatum L.)中进行真菌免疫调节蛋白(fungal immunomodulatory protein,FIP)的瞬时表达,并采用Trizal法提取植物总RNA进行了半定量RT-PCR检测。研究结果表明:外源蛋白FIP在烟草(N.tabacum)中获得了瞬时表达。本研究为新型农杆菌侵染技术的利用以及药用蛋白的生产奠定了实验基础。

转化酶抑制子调控番茄果实糖代谢的功能分析（英文）

目的:研究转化酶抑制子基因对番茄果实糖转运与积累的影响,并初步探讨其调控机制。创新点:首次在番茄果实瞬时表达系统中证明转化酶抑制子可明显抑制细胞壁转化酶活性,并且此抑制作用是通过翻译后水平发挥作用。方法:将Micro-Tom番茄分为对照组(果实未注射农杆菌及注射不含载体的空白农杆菌)和实验组(果实注射含有过表达转化酶抑制子基因的农杆菌),番茄果实分为萼片、中果肉、胶质胎座和心室隔壁四个部位,用实时定量聚合酶链式反应(qR T-PCR)技术检测转化酶抑制子和转化酶基因家族的表达变化,利用比色法分别检测了蔗糖代谢关键酶活性的变化,用高效液相色谱检测果实各部位果糖、葡萄糖和蔗糖的含量,利用高氯酸水解法测定淀粉的含量。结论:利用农杆菌注射进行果实瞬时表达后果实各部位的细胞壁转化酶活性受到明显抑制,但转化酶基因家族的转录水平表达变化不大,果糖和葡萄糖含量下降,蔗糖含量有所升高。这一结果表明Sly-INH基因主要是通过在翻译后水平对番茄细胞壁转化酶进行调控,进而影响番茄果实糖的组成与含量。本研究从分子水平对转化酶抑制子及其调控的转化酶基因家族进行了系统性研究,这为利用栽培手段调控植物体内转化酶的表达和活性,调节库组织的蔗糖的输入速率以及同化产物的分配以改善品质提供依据与技术支持。