玉米叶片原生质体瞬时转化体系的优化

为建立高效稳定的玉米叶片原生质体瞬时转化体系,以玉米品种农大108叶片为材料,用聚乙二醇(polyethylene glycol,PEG 4000)介导的瞬时转化法将报告基因增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)转化到玉米原生质体中,分析PEG 4000浓度、转化时间和质粒用量对其原生质体转化效率的影响。结果表明:当PEG 4000浓度为40%、转化时间为15 min、质粒用量为7.5μg时,玉米叶片原生质体转化效率最高,为76.98%。

“红颜”草莓原生质体制备及瞬时转化体系的建立

为探索“红颜”草莓悬浮细胞系原生质体提取的最优条件,并建立“红颜”草莓原生质体瞬时转化体系,以“红颜”草莓悬浮细胞为材料,对酶液组成、酶解温度、酶解方式进行研究。用PEG介导的瞬时转化法将标记基因GFP转化到“红颜”草莓原生质体中。结果显示:以“红颜”草莓悬浮细胞系作为分离材料,酶液组合为CPW中含有0.5%PVP+0.1%MES+1%纤维素酶+0.5%离析酶+0.01%半纤维素酶+0.9 mol/L甘露醇,在低速(50 r/min)恒温(31℃)震摇下进行酶解反应,酶解10 h时,达到“红颜”草莓原生质体最佳分离效果,每克鲜重产量可得原生质体6×108个,活力值可达93.0%。PEG介导法成功将含有绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)的植物表达载体转化“红颜”草莓悬浮细胞原生质体,转化效率达44%。通过实验筛选得到“红颜”草莓悬浮细胞原生质体的最佳制备条件,建立“红颜”草莓悬浮细胞原生质体的瞬时转化体系,为进一步开展“红颜”草莓功能基因及合成生物学研究奠定基础。

生菜瞬时转化条件优化

利用真空渗透法将改造过的包含绿色荧光蛋白(GFP)基因的pRHVnGFP载体转入生菜组织中,研究生菜的瞬时转化体系。通过对比不同的农杆菌菌株EHA105、LBA4404和GV3103,在相同条件下的转化效率,以及相同的农杆菌菌株在不同的侵染条件下的转化效率,最终确定以农杆菌LBA4404侵染生菜,菌液浓度OD 600为0.5,不添加乙酰丁香酮,抽真空并保持压力状态60 s(重复3次),作为侵染条件,可以获得最高的转化效率。