知母中知母皂苷BⅡ的TLC鉴别及HPLC法含量测定

目的:建立知母药材中知母皂苷BⅡ的 TLC 鉴别及 HPLC 含量测定方法。方法:TLC 法,展开剂:氯仿-甲醇-水(65:35:10)10℃以下放置的下层溶液为展开剂,显色剂:10%硫酸乙醇溶液,105℃加热至斑点显色清晰。HPLC 法,色谱柱:HiQ-sil C_(18)(5μm,4.6mm×250mm),流动相:甲醇-水(53:47),流速:0.8 mL·min^(-1),检测:蒸发光散射检测器(ELSD),漂移管温度:100℃,气体流速:2.6L·min^(-1)。结果:3批药材中知母皂苷 BⅡ成分的 TLC 分离效果均较好,HPLC 法测得知母皂苷 BⅡ的平均回收率为97.7%,RSD 为1.8%。结论:该方法准确可靠,可用于知母药材质量控制。

知母皂苷BⅡ对Aβ_(25-35)诱导的原代大鼠神经细胞损伤的保护作用

目的研究甾体皂苷类化合物知母皂苷BⅡ对Aβ25-35诱导的原代大鼠神经细胞损伤的保护作用。方法体外培养原代大鼠神经细胞,采用MTT(四甲基偶氮唑盐)法检测细胞增殖活性;采用分光光度法测定细胞培养液中LDH(乳酸脱氢酶)漏出率、SOD(超氧化物歧化酶)活力、MDA(丙二醛)含量以及AChE(乙酰胆碱酯酶)活力。结果知母皂苷BⅡ10-4、10-5mol.L-1能明显增强Aβ25-35(20μmol.L-1)诱导的神经细胞增殖活性,降低LDH漏出率,并能明显提高其SOD活力、降低MDA含量,同时对AChE活力具有一定的降低作用。结论知母皂苷BⅡ能明显改善Aβ25-35诱导的原代大鼠神经细胞损伤,可能与其提高模型细胞的抗氧化能力,改善胆碱能系统相关。

知母甾体总皂苷中知母皂苷BⅡ的鉴别及含量测定

目的建立知母甾体总皂苷提取物中知母皂苷BⅡ的TLC鉴别及HPLC含量测定的方法。方法 TLC法:展开剂:正丁醇-冰醋酸-水(4∶1∶5)的上层溶液,显色剂:香草醛硫酸试液,105℃加热至斑点清晰。HPLC-ELSD法:采用Agilent HC-C18(5μm,4.6 mm×250 mm),流动相:甲醇-水梯度洗脱,流速:1 ml.min-1,漂移管温度40℃,载气压力3.5 bar。结果知母皂苷BII成分的TLC分离效果较好;HPLC法测得知母皂苷BII进样量在0.506～10.12μg范围内呈良好的线性关系;平均回收率(n=6)为97.44%,RSD为1.67%。结论该方法简便准确,可用于知母甾体总皂苷提取物的质量控制。

NIRS与HPLC结合快速测定知母中知母皂苷BⅡ的含量

目的:建立知母中知母皂苷BⅡ含量的快速检测方法,实现知母皂苷BⅡ含量的快速、简便、高效测定。方法:采用中国药典中高效液相色谱法测得知母皂苷BⅡ的含量作为实测值,并采集知母样品的近红外光谱图,运用TQ Analyst 8.0数据分析软件中的偏最小二乘法(PLS),通过预处理、波段范围及主成分数的选择,将实测值与近红外光谱信息进行关联,建立知母皂苷BⅡ的最佳定量分析模型。结果:所建立的模型内部交叉验证决定系数(R^2)、校正均方差(RMSEC)、验证均方差(RMSEP)、交叉验证均方差(RMSECV)以及性能指数(PI)分别为0.975 15、0.094 2、0.080 0、0.369 20、91.0。结论:运用近红外光谱法结合HPLC建立的定量分析模型能够实现知母中知母皂苷BⅡ含量的快速准确测定。

高效液相色谱-蒸发光散射检测器法测定黄连清胃丸中栀子苷、知母皂苷AⅢ和知母皂苷BⅡ的含量

目的：应用高效液相色谱-蒸发光散射检测器（HPLC—ELSD）法测定黄连清胃丸中栀子苷、知母皂苷AⅢ和知母皂苷BⅡ的含量。方法：采用C18色谱柱（4．6mmX250mm，5μm）；流速为0．9ml／min；乙腈-水（30：70）为流动相；ELSD漂移管温度为90℃；载气（M）流速为2．9SLPM／min。结果：栀子苷、知母皂苷AⅢ和知母皂苷BⅡ进样量分别在0．0618—1．2360μg（r=0．9992）、0．0476～0．9520μg（r=0．9997）和0．1842～3．6840μg（r=0．9993）时进样量的自然对数值与峰面积的自然对数值呈良好的线性关系，平均加样回收率分别为97．67％、98．18％和98．36％，RSD分别为1．09％、1．01％和0．98％（n=6）。结论：本方法测定结果准确、灵敏、重复性好。

知母中知母皂苷BⅡ的含量测定

建立知母中知母皂苷BⅡ的含量测定方法。采用TLC法鉴定了知母中知母皂苷BⅡ;用高效液相色谱-蒸发光散射检测(HPLC-ELSD)方法测定知母中知母皂苷BⅡ的含量。色谱柱:Alltima C18(4.6mm×250 mm,5μm);流动相:乙腈-水(25∶75);流速:1.0m L/min;ELSD检测器漂移管温度:100℃;载气流速:3.0m L/min。知母皂苷BⅡ在2.0μg^80.0μg范围内线性关系良好,R为0.9996。平均回收率为99.5%,RSD为1.89%。本方法操作简单、快速灵敏,可作为知母中知母皂苷BⅡ含量的测定方法。

基于斑马鱼模型的知母皂苷BⅡ的血管保护作用及机制研究

目的:研究知母皂苷BⅡ(TB-Ⅱ)的血管保护作用,并探讨其可能的作用机制。方法:以养殖水为空白对照,考察100、200和400μg/mL TB-Ⅱ培养受精后24 h(24 hpf)的正常斑马鱼胚胎48 h后对其肠下静脉血管(SIVs)的影响。采用酪氨酸激酶抑制剂PTK787(0.06μg/mL)诱导斑马鱼肠下血管损伤模型;以0.1%二甲基亚砜、不加PTK787为空白对照,加PTK787、不加药物为模型对照,考察100、200、400μg/mL TB-Ⅱ作用48 h后对血管损伤模型斑马鱼SIVs的影响,并采用实时荧光定量-聚合酶链式反应法检测斑马鱼体内fam样酪氨酸激酶1(Flt-l)、含激酶插入区受体(Kdr)、含激酶插入区受体l(Kdr-l)、血管内皮生长因子A(VEGF-A)以及肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白细胞介素6(IL-6)mRNA的相对表达量。结果:100μg/mL TB-Ⅱ作用后可显著增加正常斑马鱼的SIVs出芽数(P<0.05),200μg/mL TB-Ⅱ作用后可显著增加正常斑马鱼的SIVs数(P<0.05)。与空白对照比较,PTK787作用后斑马鱼SIVs数显著减少(P<0.01),Flt-l、Kdr、Kdr-l、VEGF-A、TNF-α和IL-6 mRNA的相对表达量均显著降低(P<0.05或P<0.01);而经不同质量浓度的TB-Ⅱ作用后,血管损伤模型斑马鱼的SIVs数均不同程度地增加,Flt-l、Kdr、Kdr-l、VEGF-A、TNF-α和IL-6 mRNA相对表达量均不同程度地升高,除100μg/mL TB-Ⅱ作用后斑马鱼SIVs数和Flt-l、TNF-αmRNA表达量以及400μg/mL TB-Ⅱ作用后斑马鱼TNF-αm RNA表达量增加不显著外,其余指标差异均有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。结论:TB-Ⅱ具有一定的促血管新生和修复受损血管的作用,其机制可能与上调血管内皮生长因子受体和促炎细胞因子的表达相关。

知母皂苷BⅡ的提取及大孔树脂纯化工艺研究

目的:优选知母药材中知母皂苷BⅡ的提取纯化工艺。方法:以知母皂苷BⅡ提取率为考察指标,采用L9(34)正交试验,对知母皂苷BⅡ回流提取工艺进行优化;并考察8种大孔树脂对知母皂苷BⅡ的吸附和解析性能,选出最优树脂,确定最佳纯化工艺条件。结果:正交试验表明,知母皂苷BⅡ的最佳提取工艺为:50%乙醇加热回流提取2次,每次2h,溶剂用量分别为8.5倍、6倍、6倍。通过对树脂的考察,优选出对知母皂苷BⅡ吸附率和解析率都很高的HPD100树脂,上样浓度为0.23g/mL,最大上样量为4/5BV,以3BV水和6BV的20%乙醇洗脱杂质后,用5BV的50%乙醇洗脱得到质量分数为50%左右的知母皂苷BⅡ。结论:优选得到的提取工艺稳定可行,适合知母皂苷BⅡ的工业化提取生产。

HPLC-ELSD法测定栀子金花丸中知母皂苷BⅡ的含量

目的 建立高效液相色谱-蒸发光闪射检测器法测定栀子金花丸中知母皂苷BⅡ的含量。方法 采用Diamonsil-C8色谱柱，柱温为30 ℃；以乙腈-水（体积比21∶79）为流动相，流速为1.0 mL？min？1；蒸发光闪射检测器检测，漂移管温度为80 ℃，载气压力30 psi。结果 知母皂苷BⅡ质量浓度在8.2～82.0 ？g？mL -1范围内，其对数值与峰面积对数值呈良好的线性关系（r=0.999 7），平均回收率为99.1%，RSD为2.63%（n=6）。结论 该方法简便、快捷、重复性好，可用于栀子金花丸中知母皂苷BⅡ的含量测定。

基于肠道菌群代谢的知母皂苷BⅡ体外代谢转化研究

目的通过大鼠肠道菌群体外实验,观察大鼠肠道菌群对知母皂苷BⅡ的代谢转化情况。方法收集大鼠新鲜粪便,将大鼠肠道菌加入厌氧培养液得到肠道菌孵育液,加入知母皂苷BⅡ,在厌氧环境中37℃温孵24 h,经沉淀离心,取上清液,采用高效液相色谱和薄层色谱方法对知母皂苷BⅡ降解情况和代谢成分进行分析。结果知母皂苷BⅡ在大鼠粪便孵育液中很快发生代谢转化,24 h后孵育液中已检测不到知母皂苷BⅡ,能检测出较高浓度的代谢产物。代谢产物经检测为知母皂苷AⅢ。结论离体培养的大鼠肠道菌可对知母皂苷BⅡ进行代谢,初步确定代谢产物为知母皂苷AⅢ。

用HPLC-ELSD法同时测定不同产地知母饮片中芒果苷、新芒果苷和知母皂苷BⅡ的含量

目的：建立测定知母药材中芒果苷、新芒果苷和知母皂苷BⅡ含量的HPLC-ELSD方法。方法：色谱柱为Agilent Zorbax SB-C18色谱柱（250 mm×4.6 mm,5μm）;流动相为乙腈（A相）-水（用冰醋酸调节至pH3.3）（B相）;梯度洗脱：0~15 min,5%~22%A相;15~24 min,22%~23%A相;24~45 min,23%~50%A相。检测波长：254 nm;流速：1.0 ml/min;柱温：25℃;进样量20μl。ELSD条件为：漂移管温度40℃,载气（空气）压力350 kPa,增益值7,气体流量9 L/min。结果：芒果苷、新芒果苷和知母皂苷BⅡ分别在81.1~486.6μg/ml（r=0.999 8）、81.6~489.6μg/ml（r=0.999 9）和192.2~1 153.0μg/ml（r=0.999 7）范围内线性关系良好;平均回收率分别为98.75%、101.83%和99.14%;RSD分别为2.03%、2.87%和1.77%。结论：该方法简便、准确,重复性好,适用于知母药材饮片的质量控制。

HPLC—MS法测定知母中知母皂苷BⅡ的含量

目的:建立简便、灵敏、准确的测定中药知母中知母皂苷BⅡ的高效液相色谱—质谱联用检测方法,并用于中药知母中知母皂苷BⅡ的检测。方法:中药知母样品经70%乙醇水溶液室温下超声辅助萃取后,在Agilent Zorbax SB-C18柱(4.6mm×150mm,5m)上,以含0.05%甲酸的乙腈/水为流动相进行洗脱,采用电喷雾电离在负离子模式下以选择离子监测模式(SIM)检测,外标法定量。结果:知母皂苷BⅡ在0.01～1.00mg/L范围内具有良好的线性,其相关系数大于0.9990。知母皂苷BⅡ的加标平均回收率分别为102.7%和98.5%,其日内RSD为3.7%,日间RSD为4.9%,其最低定量限分别为0.02ng。结论:该法操作简便、快速,结果准确、可靠,适用于实际样品的测定。

HPLC法测定清热解毒口服液中知母皂苷BⅡ的含量

目的:建立清热解毒口服液中知母皂苷BⅡ的含量测定方法。方法:高效液相色谱法,采用辛烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱;以乙腈-水(25:75)为流动相;流速1.0mL/min;蒸发光散射检测器检测。结果:在0.04072mg/ml^2.3578mg/ml浓度范围内知母皂苷BⅡ的峰面积和浓度具有良好的线性关系,R=0.999;平均回收率为100.09%,RSD=0.27%(n=9)。结论:本方法准确、可靠、重复性好,适用于清热解毒口服液中知母皂苷BⅡ的含量控制。

HPLC-ELSD法测定知母药材中知母皂苷BⅡ的含量

目的:建立知母药材中知母皂苷BⅡ的含量测定方法。方法:HPLC-ELSD法;C8柱(4.6×150mm,5μm),流动相:乙腈-水(25:75),流速为1.0 ml/min;检测器:蒸发光散射检测器;漂移管温度:105℃;气体流速为3.0 L/min。结果:HPLC-ELSD法测得知母皂苷BⅡ的平均回收率为96.8%,RSD为1.5%。结论:该法准确可靠,简便快速,可用于知母药材的质量控制。

HPLC-ELSD法同时测定河北产道地药材不同物候期知母中知母皂苷AⅢ和知母皂苷BⅡ的含量

目的:建立同时测定知母药材中知母皂苷AⅢ和知母皂苷BⅡ含量的高效液相色谱-蒸发光散射检测法。研究不同物候期知母道地药材中2种皂苷类成分的积累动态,为最佳采收期的制定、品质评价提供参考。方法:采用Thermo C18色谱柱(4.6mm×250mm,5μm),乙腈-水梯度洗脱,流速:1mL/min,柱温:25℃。ELSD检测器雾化器流速:2.8L/min,漂移管温度:100℃。结果:知母皂苷AⅢ在0.6950-4.1700μg范围内(r=0.9993),知母皂苷BⅡ在1.0175-6.1050μg范围内(r=0.9996),进样质量的对数值与峰面积的对数值呈良好的线性关系。知母皂苷AⅢ平均回收率为99.88%,RSD=2.34%;知母皂苷BⅡ平均回收率为103.66%,RSD=0.99%。结论:该方法简便、准确、可靠,可同时测定知母药材中2种皂苷类成分的含量。不同物候期知母道地药材中两种皂苷的含量存在显著差异。

HPLC-ELSD测定知母中知母皂苷BⅡ的含量

目的:采用HPLC-ELSD法测定知母中知母皂苷BⅡ的含量,为质量标准的建立提供数据。方法:采用Agilent TC-C18(250mm×4.6mm,5μm)色谱柱,以乙腈-水(25∶75)为流动相,流速0.8mL·min-1,漂移管温度为105℃,载气流速为3.0L·min-1。结果:知母皂苷BⅡ进样量在0.785～19.6μg范围内呈良好线性关系;在药材中的平均回收率(n=6)为103.1%,RSD为1.0%。不同来源知母药材和饮片(各10批)中知母皂苷BⅡ的含量在3.84%～9.91%范围内。结论:本方法简便、准确,无干扰,可用于知母中知母皂苷BⅡ的含量测定。

HPLC-UV-ELSD同时测定知母黄柏药对提取物中盐酸小檗碱、黄柏碱、知母皂苷BⅡ

目的:建立知母黄柏药对提取物中盐酸小檗碱、黄柏碱、知母皂苷BⅡ的HPLC-UV-ELSD含量测定方法。方法:采用HPLC-UV-ELSD方法,色谱柱:Dikma C18(4.6 mm×250 mm,5μm),流动相乙腈-0.2%冰醋酸水溶液,梯度洗脱,流速1.0mL·min-1,柱温30℃,UV检测波长280 nm,蒸发光散射检测器检测,漂移管温度46℃,氮气压力1.5 Bar。结果:盐酸小檗碱、黄柏碱及知母皂苷BⅡ的线性范围分别是1.008～3.528μg(r=0.999 5),0.322～1.127μg(r=0.999 6),0.702～2.457μg(r=0.999 8),平均加样回收率分别为100.11%,98.97%,99.56%;其RSD分别为1.08%,0.90%,1.37%。结论:该法简便快速,重复性良好,结果准确可靠,可用于知母黄柏药对提取物中主要有效成分的含量测定。

HPLC-CAD法测定盐制前后知母中知母皂苷BⅡ和菝葜皂苷元

目的：利用HPLC-电雾式检测器（charged aerosol detector，CAD）联用技术建立知母中知母皂苷BⅡ和菝葜皂苷元的测定方法，并比较知母盐制前后两种成分的变化。方法知母皂苷BⅡ以乙腈-水（25∶75）为流动相，进样量为10μL；菝葜皂苷元以甲醇-水（95∶5）为流动相，进样量为20μL；其他色谱条件均采用Thermo C18柱（250 mm＆#215;4.6 mm，5μm），体积流量为1 mL/min，柱温为30℃；Corona参数：氮气压力为241.3 kPa，Filter：High，Range：200 pA。结果知母皂苷BⅡ在0.305-4.880μg线性关系良好，r＝0.9994，平均回收率为99.1%，RSD值为1.2%；菝葜皂苷元在0.490-7.840μg线性关系良好，r＝0.9991，平均回收率为98.0%，RSD值为1.3%。知母中知母皂苷BⅡ为3.16%-5.92%，盐制后为4.15%-7.20%；知母中菝葜皂苷元为0.42%-1.39%，盐制后为0.52%-1.54%。结论 CAD检测器具有较为平稳的基线和较高的灵敏度，更加适用于知母皂苷类及含有较弱或无紫外吸收成分的测定，知母盐制后知母皂苷BⅡ和菝葜皂苷元的量均有所升高。

知母皂苷BⅡ对照品的快速制备研究

目的从知母药材中快速分离制备知母皂苷BⅡ对照品。方法知母药材粗粉用80%乙醇提取,经大孔树脂D-101柱吸附,以30%乙醇洗脱,得到知母总皂苷。用制备RP-HPLC对总皂苷进行分离纯化,采用柱后分流,ELSD同时检测,收集含高质量分数知母皂苷BⅡ的组分。结果 制备产品经化学方法和13C-NMR鉴定;HPLC-ELSD检测,质量分数大于99%。结论该制备方法简单,重复性好,效率较高,所得化合物质量分数高,可用于知母皂苷BⅡ对照品的制备。

基于分子对接探究知母皂苷BⅡ对破骨细胞分化过程中的影响

目的:探究知母皂苷BⅡ(TBⅡ)对破骨细胞分化过程中核转录因子-κB受体活化因子配基(RANKL),RANK,原癌基因(C-FOS)基因表达量的影响。方法:利用分子对接软件LeDock对TBⅡ分别与RANKL,RANK和C-FOS进行分子对接打分。RAW264.7细给予可溶性RANKL(sRANKL)干预,设立空白组,sRANKL组(模型组),淫羊藿苷(Ica)组,TBⅡ低剂量组(2μmol·L^-1),TBⅡ中剂量组(4μmol·L^-1),TBⅡ高剂量组(8μmol·L^-1)。相应试剂盒检测破骨细胞分化的标志性酶(TRAP),实时荧光定量聚合酶链式反应(Real-time PCR)检测C-FOS,与其上游RANKL/RANK和下游活化T细胞核因子胞质1型(NFATC1)表达量,以及骨保护素OPG的表达量。结果:分子对接打分结果分别为-11.86,-11.38,-12.34 kcal·mol^-1,TBⅡ能够与RANKL,RANK和C-FOS结合。与正常组比较,模型组TRAP含量显著升高(P<0.01);与模型组比较,各给药组显著降低TRAP含量(P<0.01),且TBⅡ呈剂量依赖性降低TRAP含量。与正常组比较,模型组RANKL,RANK,C-FOS,NFATC1表达量显著升高(P<0.01),OPG表达量显著降低(P<0.01);与模型组比较,各给药组显著降低RANKL,RANK,C-FOS,NFATC1表达量(P<0.01),显著升高OPG表达量(P<0.01)。结论:TBⅡ可能通过调控RANKL/RANK/C-FOS信号通路,抑制破骨细胞前体细胞向破骨细胞的分化,抑制破骨细胞活性,减少骨吸收,改善骨质疏松。