基于血清药物化学和网络药理学的知母-黄柏药对盐炙前后治疗2型糖尿病药效物质基础及作用机制分析

目的基于液质联用技术对生知母-生黄柏、盐知母-盐黄柏药对水提液灌胃给药后大鼠入血成分分析,结合网络药理学预测盐炙在知母-黄柏药对治疗2型糖尿病的影响,并通过体外实验进行初步验证。方法大鼠连续灌胃给药生知母-生黄柏药对、盐知母-盐黄柏药对水提液2次,中间间隔1 h,末次给药60 min后腹主动脉取血,用甲醇沉淀蛋白法处理后复溶,采用色谱柱Shim-pack GIST C 18(4.6 mm×150 mm,5μm);流动相A相为0.1%甲酸水,B相为0.1%甲酸-乙腈;梯度洗脱,正、负离子全扫描模式,质量扫描范围m/z 100~1500。结合数据库二级谱图及文献,分析鉴定生知母-生黄柏、盐知母-盐黄柏药对的入血成分。检索2型糖尿病疾病靶点,对入血成分和疾病的交集靶点进行蛋白质互作网络分析、GO、KEGG通路富集分析,构建“入血成分-靶点”网络图,运用AutoDock软件对筛选出的核心成分和核心靶点进行分子对接验证。验证实验以HepG2细胞为实验对象,胰岛素联合高糖诱导胰岛素抵抗模型,CCK8法检验盐炙前后知母-黄柏药对对细胞增殖影响,Western blot检测PI3K-AKT信号通路相关蛋白的表达情况。结果生知母-生黄柏药对水提液大鼠血清中鉴定出15种原型成分,1个芒果苷代谢成分。盐知母-盐黄柏药对水提液大鼠血清中鉴定出17个原型成分,1个芒果苷代谢成分。盐炙后入血成分中芒果苷、小檗碱、3-异丁基戊二酸等成分含量较生品高。KEGG和GO结果显示,知母-黄柏药对治疗2型糖尿病可能与RNA聚合酶的转录调控、炎症反应、AGE-RAGE、PI3K-AKT、胰岛素抵抗等通路有关。细胞实验表明盐炙前后知母-黄柏药对可以上调p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT、GLUT4蛋白表达,且盐炙组效果优于生品组。结论初步阐释了知母-黄柏药对盐炙前后入血成分,阿魏酸、小檗碱、小檗红碱、芒果苷与mTOR、SIRT1、EGFR、PPARA等可能是知母-黄柏药对盐炙后增强2型糖尿病治疗效果的主要成分和靶点,其机制可能是增强了PI3K-AKT等相关通路的作用,为知母-黄柏药对盐炙前后药效物质基础研究及临床应用提供重要参考。

滋肾通关方中肉桂反佐配伍对黄柏-知母药对在大鼠体内活性成分组织分布的影响

目的探讨滋肾通关方中肉桂反佐配伍对黄柏-知母药对的活性成分在正常大鼠体内组织分布的影响及其作用机制。方法将56只Wistar大鼠随机分为空白组(等量生理盐水),滋肾通关方低、中、高剂量组(5,10,20 g/kg),黄柏-知母药对低、中、高剂量组(5,10,20 g/kg),各8只。分别灌胃相应药物1 h后取大鼠心、肝、脾、肺、肾组织并制备匀浆液,采用超高效液相色谱串联质谱法测定大鼠体内组织匀浆液中黄柏碱和知母皂苷AⅢ的含量。结果与黄柏-知母药对低、中、高剂量组比较,滋肾通关方低、中、高剂量组大鼠心、肝、脾、肺、肾组织匀浆液中黄柏碱和知母皂苷AⅢ的含量整体更高;滋肾通关方高剂量组大鼠肺组织匀浆液中黄柏碱和知母皂苷AⅢ的含量显著高于黄柏-知母药对高剂量组(P<0.05),滋肾通关方低剂量组大鼠心组织中黄柏碱的含量显著高于黄柏-知母药对低剂量组(P<0.05)。结论滋肾通关方中肉桂反佐配伍黄柏-知母药对的作用机制可能与改变药对中活性成分在组织中的分布有关。

HPLC-UV-ELSD同时测定知母黄柏药对提取物中盐酸小檗碱、黄柏碱、知母皂苷BⅡ

目的:建立知母黄柏药对提取物中盐酸小檗碱、黄柏碱、知母皂苷BⅡ的HPLC-UV-ELSD含量测定方法。方法:采用HPLC-UV-ELSD方法,色谱柱:Dikma C18(4.6 mm×250 mm,5μm),流动相乙腈-0.2%冰醋酸水溶液,梯度洗脱,流速1.0mL·min-1,柱温30℃,UV检测波长280 nm,蒸发光散射检测器检测,漂移管温度46℃,氮气压力1.5 Bar。结果:盐酸小檗碱、黄柏碱及知母皂苷BⅡ的线性范围分别是1.008～3.528μg(r=0.999 5),0.322～1.127μg(r=0.999 6),0.702～2.457μg(r=0.999 8),平均加样回收率分别为100.11%,98.97%,99.56%;其RSD分别为1.08%,0.90%,1.37%。结论:该法简便快速,重复性良好,结果准确可靠,可用于知母黄柏药对提取物中主要有效成分的含量测定。

知母黄柏药对对肥胖症大鼠模型降脂作用的实验研究

目的探讨不同剂量的知母黄柏药对(ZB)对高脂饲料诱导肥胖症大鼠的降脂作用及其可能的作用机制。方法雄性SD大鼠62只,随机分为正常组12只,造模组52只。正常组给予普通饲料喂养,造模组以高脂饲料喂养24周;造模第21周,将造模组大鼠随机分为模型组,知母黄柏药对高、中、低剂量组(3.00,1.00,0.33g·kg^(-1)·d^(-1)),盐酸吡格列酮阳性药组(5.25mg·kg^(-1)·d^(-1)),每组各10只。正常组与模型组灌服等体积蒸馏水,其他实验组相应处理,持续22天,于24周末处理大鼠,取血清及肝组织,测量血清甘油三酯(TG),胆固醇(CHO)及总胆汁酸(TBA)水平变化,观察肝组织病理变化(HE染色)。结果与正常组比较,模型组大鼠血清TG、CHO含量均显著升高(P<0.01),血清TBA含量也显著升高(P<0.05);与模型组比较,知母黄柏高剂量组及知母黄柏中剂量组TG、TBA水平均显著降低(P<0.01),盐酸吡格列酮组TG水平显著降低(P<0.05),知母黄柏低剂量组和盐酸吡格列酮组TBA水平显著降低(P<0.01),组织病理显示,知母黄柏药对使各剂量组大鼠肝细胞脂肪变性、气球样变及炎症的程度明显减轻。结论知母黄柏药对不同剂量对肥胖症均具有良好的预防和治疗的作用,其机制可能与改善脂质代谢,调节胆汁酸代谢等有关。

基于网络药理学、分子对接及实验验证研究知母-黄柏药对抗炎的物质基础

本研究通过检索知母、黄柏化学成分作用靶点及炎症相关靶点,并对其进行功能及通路预测、分析,采用分子对接方法验证靶点。利用液质联用技术对分子对接中打分最高的脱水淫羊藿素进行含量测定,并通过细胞实验对知母-黄柏及脱水淫羊藿素的作用进行验证,以探究知母-黄柏药对抗炎的物质基础及作用机制。通过检索得到知母-黄柏药对的52个化合物及619个作用靶点、疾病靶点538个,交集靶点包括PRSS1、PTGS1、PPARG、NR3C1、RELA、VEGFA、CASP3、CASP8等。筛选得到核心化学成分槲皮素、脱水淫羊藿素、β-谷甾醇。KEGG结果表明知母-黄柏药对抗炎的主要通路包括TNF信号通路、AGE-RAGE信号通路、疱疹病毒感染等。分子对接结果表明核心化学成分脱水淫羊藿素与核心靶点PPARG有较高的结合活性,含量测定结果表明脱水淫羊藿素在知母-黄柏中含量为18.04%,细胞实验结果表明知母-黄柏、脱水淫羊藿素能显著抑制NO、TNF-α、IL-6的产生。因此,知母-黄柏治疗炎症的物质基础是以脱水淫羊藿素为主的化学成分,脱水淫羊藿素可能是通过TNF通路发挥抗炎作用。

知母-黄柏药对抗炎药效部位筛选及作用机制研究

目的:筛选知母-黄柏药对的抗炎药效部位,并初步对其抗炎机制进行探讨。方法:制备知母-黄柏药对水煎液,通过D101树脂进行分离,分别用水、30%、60%、95%乙醇-水进行洗脱,制备不同极性部位。采用LPS诱导RAW264.7细胞炎症模型,用不同浓度的药对或各极性部位预处理细胞,MTT法检测细胞凋亡,Griess法检测NO分泌,筛选抗炎活性部位。ELISA法检测炎症因子分泌,Western blot检测炎症相关蛋白COX-2、iNOS蛋白水平及细胞核、细胞质中NF-κB p65含量。结果:知母-黄柏药对及30%醇洗部位能降低LPS诱导RAW264.7细胞分泌NO,其中30%醇洗部位作用更为明显,其他部位无显著作用。30%醇洗部位能显著降低LPS诱导的IL-1β、IL-6、TNF-α分泌及iNOS、COX-2蛋白表达,并促进p65由细胞质进入细胞核。结论:知母-黄柏药对抗炎药效部位为30%醇洗部位,该药效部位可能通过抑制NF-κB信号通路,抑制iNOS、COX-2表达及相关炎症因子的分泌,保护LPS诱导的RAW264.7细胞损伤。

药对知母-黄柏对胰岛素抵抗的改善作用

目的 研究药对知母-黄柏(ZB)对胰岛素抵抗(IR)的改善作用。方法采用高脂高糖饲料联合链脲佐菌素建立2型糖尿病大鼠模型。随机分为正常组、模型组、二甲双胍组、知柏高、低剂量组(ZB 4.5、1.5 g·kg -1 ),连续灌胃给药4周。检测体质量、空腹血糖(FBG)、血清胰岛素水平(FINS)及甘油三脂含量(TG),计算胰岛素敏感指数(ISI)和胰岛素抵抗指数(Homa-IR)。另以棕榈酸和油酸联合诱导HepG2细胞产生IR。分为正常组、模型组、二甲双胍组、知柏高、中、低剂量组(ZB384、192、96 mg·L^-1 ),各组给药24 h后检测糖耗量及TG含量。结果药对知母-黄柏能明显降低糖尿病大鼠的FBG、FINS、TG含量( P <0.05)及Homa-IR( P <0.01),提高ISI( P <0.05),并能明显降低HepG2-IR细胞的TG含量( P <0.05),提升糖耗量( P <0.05)。结论药对知母-黄柏能提升胰岛素敏感性,促进糖脂代谢,对胰岛素抵抗具有改善作用。

知母-黄柏药对改善D-半乳糖诱导衰老小鼠认知障碍的机制研究

目的:研究知母-黄柏药对(简称“知柏”)对D-半乳糖(D-gal)诱导衰老模型小鼠认知障碍的改善作用,并探讨其作用机制。方法:将75只C57BL/6J小鼠随机分为空白组、模型组(D-gal 125 mg/kg)、吡拉西坦组(468 mg/kg)、知柏组(4.5 g/kg)和雷帕霉素哺乳靶蛋白(mTOR)抑制剂组(依维莫司,RAD001,3mg/kg),每组15只。通过D-gal建立小鼠衰老模型,并连续8周灌胃给予知柏水煎液。采用Morris水迷宫和新物体识别测试评价衰老模型小鼠的认知功能;HE染色法观察各组小鼠海马组织病理变化情况;尼氏染色和高尔基染色观察海马区神经元和突触的病理形态变化;收集海马组织以测定脑内三磷酸腺苷(ATP)含量,Western Blot法检测海马中泛素结合蛋白62(P62)、肌球蛋白样BCL2结合蛋白(Beclin-1)、突触素(Syn)、突触后密度蛋白-95(PSD-95)、腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)、mTOR的蛋白表达水平;实时荧光定量PCR(qRT-PCR)法检测海马中Syn、AMPK、mTOR基因表达水平。结果:与空白组相比,模型组小鼠在Morris水迷宫和新物体识别测试中表现出认知功能显著降低(P<0.01)。在模型组中,海马区的细胞数量减少,细胞排列松散,神经元形态不规则,尼氏小体数量明显减少,树突分支数量以及树突棘密度也显著减少。模型组小鼠海马中ATP水平、P62、Syn、PSD-95、mTOR蛋白表达显著降低(P<0.01),Beclin-1表达显著升高(P<0.01),pAMPK/AMPK蛋白含量比值和AMPK基因表达显著升高(P<0.01),Syn和mTOR基因表达显著降低(P<0.01)。与模型组相比,吡拉西坦组和知柏组小鼠的认知功能得到了显著改善,表现为Morris水迷宫测试中潜伏期的显著缩短(P<0.01),穿越平台次数和靶象限停留时间显著增加(P<0.01),以及新物体识别指数的显著升高(P<0.01),海马区树突棘密度显著增加(P<0.01),神经元损伤也在一定程度上得到了缓解。海马中ATP水平、P62、Syn、PSD-95和mTOR蛋白表达显著升高(P<0.01,P<0.05),Beclin-1蛋白表达显著降低(P<0.01),pAMPK/AMPK蛋白含量比值和AMPK基因表达显著降低(P<0.01,P<0.05),Syn、mTOR基因表达显著升高(P<0.01)。抑制剂RAD001组与模型组结果相似,经知柏治疗后上述指标均有所回调。结论:知柏可能通过激活AMPK/mTOR信号通路抑制神经元过度自噬,增强突触可塑性,改善由D-gal引起的小鼠认知障碍。

知母-黄柏药对有效部位群改善2型糖尿病大鼠认知功能障碍的药效及机制研究

目的研究知母-黄柏药对有效部位群通过磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K)/蛋白激酶B(PKB/Akt)通路改善2型糖尿病模型大鼠认知功能障碍的药效及作用机制。方法 50只雄性SD大鼠随机分为5组,每组10只,分别为对照组、模型组、知母-黄柏药对有效部位群高剂量(ZBH,2.0 g/kg)和低剂量(ZBL,1.0 g/kg)组、盐酸美金刚(MHT,1.0 mg/kg)组;采用ip链脲佐菌素(STZ)联合喂食高脂饲料的方法制备2型糖尿病大鼠模型;造模成功后各组大鼠开始ig给药,连续给药20周,分别在给药8、16周时测定大鼠血浆中β淀粉样蛋白1-42(Aβ1-42)水平,并结合Barnes迷宫、Morris水迷宫法检测大鼠的认知能力;给药20周后,取大鼠胰腺、海马组织进行形态学观察;q RT-PCR检测PI3K、Akt、Bcl-2基因在大鼠脑组织中的表达。结果给药8、16周时,与对照组相比,模型组大鼠血浆中Aβ1-42蛋白水平显著升高(P<0.05、0.01),与模型组相比,MHT、ZBH组Aβ1-42蛋白水平均降低(P<0.05);行为学检测结果显示,与模型组相比,各给药组均能不同程度改善大鼠记忆能力(P<0.05、0.01);给药20周,大鼠海马CA1区病理结果显示,对照组大鼠海马区神经元排列整齐、形态规则、着色均匀。模型组大鼠大量神经元细胞核深染、固缩,神经元细胞排列紊乱,部分细胞被小胶质细胞代替。与模型组相比,ZBH、ZBL可有效改善大鼠海马组织神经元形态及细胞排列形态,修复神经损伤;q RT-PCR结果显示,与对照组相比,模型组大鼠脑组织PI3K、Akt mRNA表达有一定程度的降低,抗凋亡基因Bcl-2 mRNA表达减弱(P<0.05),MHT、ZBH均能不同程度上调PI3K、Akt、Bcl-2 mRNA的表达(P<0.05、0.01)。结论知母-黄柏药对有效部位群能明显降低Aβ1-42蛋白水平,上调PI3K、Akt mRNA的水平,对海马神经元具有修复和保护作用,说明知母-黄柏药对有效部位群可能通过调节PI3K/Akt通路而实现对2型糖尿病大鼠认知功能障碍的改善。

知母-黄柏药对盐炙前后对肾阴虚大鼠滋阴清热作用的影响

目的比较知母-黄柏药对盐炙前后对糖皮质激素致肾阴虚大鼠滋阴清热作用的影响。方法将70只Wistar大鼠随机分成空白组,模型组,生知母-黄柏高、低剂量组(8.64、2.16 g·kg^-1),盐知母-黄柏高、低剂量组(8.64、2.16 g·kg^-1)及知柏地黄丸组(0.81 g·kg^-1),每组10只,雌雄各半。大鼠灌胃给药(10 mL·kg^-1),每天给药1次,连续10 d;除空白组外,各组从第7天开始灌胃氢化可的松注射液(50 mg·kg^-1),连续4 d。实验期间观察大鼠体征,末次给予氢化可的松后采集两侧肾上腺、甲状腺,并计算其脏器指数;采用ELISA法检测大鼠血浆环磷酸腺苷(cAMP)、环磷酸鸟苷(cGMP)含量和血清皮质酮(CORT)、肌酐(CRE)水平;采用超微量ATP酶(Na^+-K^+)测试盒测定大鼠肝、肾及小肠组织中Na^+-K^+-ATP酶的活力。结果与空白组比较,模型组大鼠的肾上腺、甲状腺脏器指数均明显降低(P<0.01);血浆cGMP含量明显降低,cAMP含量及cAMP/cGMP比值明显升高(P<0.01);血清CORT、CRE含量明显升高(P<0.01);肝脏、肾脏及小肠的Na^+-K^+-ATP酶活力明显升高(P<0.01,P<0.05)。与模型组比较,盐知母-黄柏高剂量组的大鼠肾上腺脏器指数明显升高,各给药组大鼠的甲状腺脏器指数均显著升高(P<0.05,P<0.01);各给药组大鼠的血浆cAMP含量、cAMP/cGMP比值均明显降低,除生知母-黄柏低剂量组外其余各给药组大鼠的血浆cGMP含量明显升高(P<0.05,P<0.01);各给药组大鼠的血清CORT、CRE含量明显降低(P<0.05,P<0.01);盐知母-黄柏高、低剂量组的肝脏Na^+-K^+-ATP酶活力明显降低,各给药组的肾脏Na^+-K^+-ATP酶活力明显降低,生/盐知母-黄柏高剂量组的小肠Na^+-K^+-ATP酶活力明显降低(P<0.01,P<0.05)。等剂量的生/盐知母-黄柏组之间比较,盐知母-黄柏高剂量组大鼠的血浆cAMP含量、cAMP/cGMP比值均明显降低(P<0.05),血清CORT、CRE含量亦明显降低(P<0.05);盐知母-黄柏低剂量组的肝脏、肾脏Na^+-K^+-ATP酶活力与盐知母-黄柏高剂量组的肾脏、小肠Na^+-K^+-ATP酶活力均明显降低(P<0.05)。结论生/盐知母-黄柏药对对肾阴虚大鼠均有滋阴清热作用,但经盐炙后知母-黄柏的滋阴清热作用在一定程度上得到增强。