NTE基因ShRNA慢病毒载体的构建与鉴定

【目的】构建神经病靶酯酶(NTE)蛋白低表达的ShRNA重组慢病毒表达系统。【方法】依照ShRNA序列设计原则设计带酶切位点的NTE ShRNA序列,与表达载体pLL3.7连接构建NTE ShRNA重组表达质粒,转染DH5α菌观察重组表达状况,与pCVM-VSV-G包膜质粒和pCMV-dr8.2dvpr表达质粒共转染293T细胞,包装得到重组慢病毒。用病毒稀释法以绿色荧光蛋白(GFP)为标记,确定转染效率及病毒含量。【结果】经酶切及测序鉴定结果显示成功构建pLL3.7-NTE ShRNA慢病毒载体。重组慢病毒质粒与辅助质粒共转染293T细胞后获得高表达的细胞,共转染48h后,收集病毒液检测病毒滴度达4.5×10~4/mL。【结论】成功构建NTE ShRNA慢病毒重组表达系统。

靶向呼吸道合胞病毒M2基因pshRNA载体质粒的构建及意义

目的:构建针对呼吸道合胞病毒(RSV)M2基因m RNA的短发卡结构状RNA(shRNA)重组载体质粒,为利用RNA干扰技术抗RSV感染的深入研究奠定基础;方法:按shRNA设计原则,选择RSV-M 2基因作为靶基因,设计19bp长的能产生短发卡结构的两段DNA反向重复序列,中间以9bp序列间隔,经退火形成互补双链,克隆至转录载体pgenesil-1上,重组质粒经酶切和测序鉴定,然后将构建成功的重组质粒转染H EP2细胞,荧光显微镜下观察绿色荧光细胞发生率以评估转染效率。结果:将设计合成的DNA片段成功克隆至载体上,经酶切及序列鉴定为目的序列,并且荧光显微镜下观察细胞有较多的绿色荧光蛋白表达。结论:成功构建了针对RSV M 2基因m RNA的shRNA重组载体质粒,可利用重组质粒进一步研究其对RSV感染的抑制,从而为抑制RSV感染寻找新的基因治疗手段。

靶向细胞周期蛋白E的shRNA真核表达载体的构建和鉴定

[目的]构建靶向细胞周期蛋白E的shRNA真核表达载体。[方法]针对cyclin E基因,设计1对寡核苷酸,形成双链后将其将其插入Psilencer2.1-U6-neo质粒,构建cyclin E shRNA真核表达载体,酶切和测序鉴定。转染MCF-7细胞株,应用western blot检测cyclin E蛋白的表达。[结果]酶切和测序结果显示,成功构建特异性针对cyclin E的shRNA表达质粒。转染MCF-7细胞后下调cyclin E的表达。[结论]成功构建靶向cyclin E的shRNA真核表达载体,为进一步应用RNAi技术进行肿瘤基因治疗的研究提供实验基础。