ITGA5慢病毒shRNA表达载体及Bel-7404稳定细胞系的构建

目的构建整合素α5基因(ITGA5)的短发卡RNA(shRNA)慢病毒表达载体,并建立稳定沉默ITGA5表达的肝癌细胞系Bel-7404。方法设计3条ITGA5基因特异性shRNA靶序列和1条非特异性序列作为阴性对照(NC),分别克隆到GV493质粒载体中,转化感受态细胞后挑取阳性克隆子进行DNA测序鉴定,包装成重组慢病毒,并纯化、测定病毒滴度。将4组慢病毒载体分别感染人肝癌细胞Bel-7404,使用嘌呤霉素筛选后,在荧光显微镜下观察GFP的表达,q PCR和Western blot分别检测各组中ITGA5的基因和蛋白质表达水平。结果 ITGA5基因shRNA慢病毒表达载体经过测序鉴定构建成功,q PCR和Western blot检测结果显示3种慢病毒干扰组的ITGA5表达水平均低于NC组(P均<0.05)。NC组m RNA的表达量为(100±2.3)%,ITGA5-shRNA-1、ITGA5-shRNA-2、ITGA5-shRNA-3组m RNA相对表达量分别为(10.7±3.7)%、(16.7±1.5)%、(11.8±2.9)%,且其干扰效率均达到70%以上,可选择其中一个干扰靶点进行后续实验。结论成功构建ITGA5基因shRNA慢病毒表达载体,感染肝癌Bel-7404细胞并成功筛选出稳定沉默细胞系,为进一步研究ITGA5在肝癌中的生物学功能和作用机制提供了实验基础。

靶向 survivin 基因的 shRNA 慢病毒载体的构建及其对膀胱癌 EJ 细胞凋亡的影响

目的:构建survivin基因特异性shRNA慢病毒干扰载体,转染膀胱癌EJ细胞,研究survivin基因在膀胱癌细胞株中的表达抑制情况,观察survivin shRNA慢病毒载体对EJ细胞凋亡的影响.方法:以survivin基因为靶标设计shRNA干扰序列,克隆至p SIH1-H1-cop GFP慢病毒载体.干扰载体鉴定正确后转染膀胱癌细胞株EJ细胞,荧光显微镜下观察GFP表达情况,实时荧光定量PCR检测survivin基因mRNA含量变化,Western blotting法检测survivin蛋白表达,Annexin V-FITC/PI双染法检测EJ细胞凋亡情况.结果:PCR扩增鉴定、DNA测序证实survivin慢病毒干扰载体构建成功;EJ细胞经干扰载体处理后,EJ细胞survivin基因mRNA水平下调了73.33%,蛋白表达受到显著抑制,EJ细胞凋亡率达到24.39%.结论:成功构建了靶向survivin基因的shRNA重组慢病毒干扰载体,可以显著降低转染细胞survivin基因的表达水平,并有效提高膀胱癌细胞凋亡率.

稳定敲低Mg^(2+)/Mn^(2+)依赖性蛋白磷酸酶1A(PPM1A)的BV2细胞系建立

目的构建Mg^(2+)/Mn^(2+)依赖性蛋白磷酸酶1A(PPM1A)基因的短发卡RNA(shRNA)慢病毒表达载体,并建立稳定敲低PPM1A表达的BV2小鼠脑小胶质细胞系。方法针对PPM1A基因的编码序列(CDS)区,设计合成2对短发卡RNA(shRNA)序列shRNA1、shRNA2,分别将其克隆到GV493载体中,并转化至感受态大肠杆菌DH5α菌株,培养后挑取阳性克隆子进行测序,最后包装慢病毒并进行滴度测定。将2组慢病毒分别转染BV2小鼠脑小胶质细胞,并给予嘌呤霉素筛选,使用荧光显微镜及流式细胞术观察绿色荧光蛋白(GFP)的表达,评估转染结果,分别采用实时定量PCR和Western blot法检测PPM1A的mRNA和蛋白水平。结果 PPM1A基因shRNA慢病毒表达载体经过测序鉴定构建成功,转染BV2小鼠脑小胶质细胞后GFP表达率大于80%;与对照组相比,shRNA1及shRNA2敲低组PPM1A mRNA及蛋白水平均显著降低。结论利用慢病毒shRNA方法成功构建PPM1A敲低的BV2细胞系。

组蛋白乙酰化酶RNAi慢病毒文库构建及其对胆囊癌细胞的感染

目的构建人基因组中16个组蛋白乙酰化酶的短发卡RNA(shRNA)慢病毒载体文库,为进一步研究表观遗传因子对胆囊癌的调控机制提供有利的工具。方法依据shRNA引物设计原则,分别针对每个基因设计4对shRNA引物,将引物退火形成粘性末端后连接至慢病毒载体;经菌落PCR、酶切验证正确后,进行转化及质粒抽提。结果构建了16个组蛋白乙酰化酶基因的shRNA慢病毒载体,共64个shRNA慢病毒载体克隆;并对胆囊癌细胞SGC996和GBC-SD进行了病毒感染的MOI值(multiplicity of infection)摸索,以确保可通过RNAinterference(RNAi)慢病毒干扰的方式对这两株细胞进行研究。结论成功构建了16个组蛋白乙酰化酶的shRNA慢病毒载体,从而为在SGC996和GBC-SD胆囊癌细胞中研究人组蛋白乙酰化酶奠定坚实的基础。

SGK1基因沉默对人乳腺癌细胞生长抑制作用

目的观察血清和糖皮质激素调节蛋白激酶1(SGK1)基因沉默对人乳腺癌细胞生长抑制作用,为探讨乳腺癌治疗靶点提供实验依据。方法采用RNA干扰技术,以pGenesil 3为载体,建立针对SGK1的短发卡RNAC(shRNA)干扰质粒pGen-3-siSGK1和阴性对照质粒pGen-3-control,转染人乳腺癌细胞系MDA-MB-231,经筛选得到稳定SGK1基因沉默的乳腺癌细胞模型;采用实时定量PCR法、免疫荧光法以及蛋白免疫印迹法,检测shR-NA干扰组、阴性对照组及未转染组细胞中SGK1的表达;采用体外浸润实验、细胞迁移实验检测各组细胞的侵袭和转移能力,噻唑蓝比色法检测细胞体外生长能力。结果成功构建针对SGK1基因的shRNA干扰质粒,建立稳定的SGK1基因沉默乳腺癌细胞模型;模型细胞中SGK1蛋白表达量与对照组相比下降了60%(P<0.01);β-catenin与SGK1表达条带亮度均明显下降;PGen-3-siSGK1组SGK1 mRNA相对含量(RQ)为0.35,低于其他2组(分别为0.96、1.00),与pGen-3-control组相比下降了65.5%,差异有统计学意义(P<0.05),高倍显微镜视野下,pGen-3-siSGK1组的穿膜细胞数为22个/HPF,其他2组分别为66、62个/HPF;pGen-3-siSGK1组的细胞迁移率为17.01%,其他2组分别为72.22%、68.47%;凝血酶不同浓度下pGen-3-siSGK1组细胞生长均受到抑制,生长速度缓慢,其中0.1、1.0 U/mL浓度下,细胞含量(吸光度)分别为0.10、0.05,远低于其他2组,差异均有统计学意义(均P<0.05)。结论 SGK1基因沉默可抑制SGK1基因表达,可使人乳腺癌细胞MDA-MB-231株的浸润能力、迁移能力下降,抑制乳腺癌细胞生长。