人Bcl-2基因短发夹样RNA真核表达载体的构建和鉴定

目的构建人Bcl-2基因序列特异性的短发夹样RNA(Short Hairpin RNA,shRNA)质粒载体。方法根据Bcl-2基因序列及shRNA设计原则,化学合成4段编码短发夹RNA的寡核苷酸序列,将其定向克隆到带有卡那霉素抗性和增强绿色荧光蛋白的真核表达载体pGPH1/GFP/Neo中H1启动子的下游,重组构建RNAi质粒,同时设立阴性对照,并对重组质粒进行酶切分析和DNA序列测定。结果限制性内切酶PstI和BamHI酶切显示设计合成的shRNA编码序列被成功插入pGPH1/GFP/Neo质粒中,测序结果证实插入片断与设计序列完全一致。结论针对人Bcl-2的shRNA真核表达载体成功构建及鉴定为进一步研究Bcl-2功能奠定了良好的基础。

靶向srGAP家族的串联短发夹RNA表达

为了解析不同srGAP蛋白在神经元发育中的补偿效应,构建了一种同时靶向srGAP家族成员srGAP1～3的串联短发夹RNA表达系统.通过设计,合成多个寡核苷酸,利用微小RNA表达载体构建相应srGAP基因的短发夹RNA表达质粒,并利用蛋白免疫印迹法筛选敲减作用明显的靶向不同srGAP基因的短发夹RNA,然后,将其串联到同一载体而构建成可以同时靶向srGAP家族的短发夹RNA串联重组质粒.结果表明,筛选得到了分别针对srGAP1～3的短发夹RNA J17、J24和J33,并构建出能够同时靶向srGAP1～3基因的串联短发夹RNA J1+2+3.

ShRNA-LDH纳米颗粒的制备及薇甘菊生物防治

核糖核酸干扰(ribonucleic acid interference,RNAi)技术在植物保护中具有高效、安全和环保的特点.外源喷施短发夹RNA(short hairpin RNA,shRNA)可以有效沉默薇甘菊(Mikania micrantha)叶绿素a/叶绿素b结合蛋白相关基因.为提高喷施shRNA对薇甘菊的防治效果,制备直径为10~100 nm的层状双氢氧化物(layered double hydroxide,LDH)黏土纳米片为shRNA的载体,该载体具有良好的生物相容性,具环境友好.研究发现,LDH结合shRNA的最佳质量比为1∶10.shRNA喷施实验表明,有轻微创伤的薇甘菊叶片对shRNA更敏感,并且LDH直接喷施对薇甘菊的生长几乎没有任何影响.为比较LDH-shRNA和单独的shRNA对薇甘菊的控制效果,利用分别搭载了6个shRNA的LDH纳米颗粒或单独的shRNA喷施薇甘菊叶片,在喷施6 d后观察到叶片喷施LDH-shRNA有更加明显的坏死表型.研发的基于LDH的shRNA携带系统可显著提高RNAi在防控薇甘菊中的有效性.

靶向抑制人木糖基转移酶-I基因的shRNA真核表达载体的构建

目的构建靶向抑制人木糖基转移酶-Ⅰ(XT-Ⅰ)基因的短发夹状RNA(shRNA)真核表达载体,为探讨唾液腺肿瘤性肌上皮细胞合成及分泌蛋白多糖(PG)的研究奠定基础。方法根据GenBank提供的XT-Ⅰ基因序列,设计短链寡核苷酸,化学合成后经退火形成双链DNA片段,克隆到Pgenesil-1载体中,构建shRNA真核表达载体WJ1-WJ6,行酶切及核酸测序鉴定;将构建的XT-Ⅰ特异性shRNA表达载体转染体外培养的人唾液腺腺样囊性癌细胞株ACC-M,在荧光倒置显微镜下观察绿色荧光蛋白的表达,流式细胞术检测转染效率,并采用半定量RT-PCR和Western blot分别检测转染后细胞XT-Ⅰ基因mRNA和蛋白表达水平的变化。结果经酶切、连接后构建的6个质粒命名为WJ1、WJ2、WJ3、WJ4、WJ5、WJ6。酶切及核酸测序鉴定证实,构建的shRNA表达载体WJ1-WJ6序列正确;转染WJ1-WJ6后ACC-M细胞均可表达绿色荧光;流式细胞术测定转染效率平均为50.26%;RT-PCR结果显示,WJ3显著抑制XT-Ⅰ mRNA的表达,抑制率为72.39%;Western blot结果显示,WJ3有效抑制XT-Ⅰ的蛋白表达,抑制率为70.18%。结论成功构建靶向抑制XT-Ⅰ的shRNA真核表达载体WJ1-WJ6,其中WJ3可高效抑制XT-Ⅰ基因mRNA及蛋白水平的表达,为唾液腺肿瘤中PG的RNAi研究奠定了基础。

应用shRNA技术研究NDRG2在人胃癌细胞SGC7901增殖中的作用

目的:构建针对人 N-myc 下游调节基因2(NDRG2)的短发夹 RNA(shRNA)表达载体 pSNAV-shRNA,观察其在SGC7901细胞中对 NDRG2的抑制作用以及 NDRG2被抑制后细胞增殖能力的变化。方法:PCR 扩增针对 NDRG2的 shRNA 表达框架,构建 pSNAV-shRNA 质粒,转染 SGC7901细胞,通过 RT-PCR,免疫印迹试验检测其对 NDRG2表达的影响;通过细胞周期分析,软琼脂集落形成试验检测细胞增殖能力的变化。结果:将构建好的 pSNAV-shRNA 质粒转染 SGC7901细胞后,NDRG2的表达受到明显的抑制,细胞周期 G1期阻滞,集落形成能力降低。结论:构建的 pSNAV-shRNA 质粒能够有效抑制NDRG2在 SGC7901细胞中的表达,降低 SGC7901细胞的增殖能力。

PCR扩增的shRNA表达盒快速筛选PRRSV有效siRNA序列

有效siRNA的筛选是RNAi研究的关键点之一。本研究选取猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的核衣壳蛋白(N)作为靶基因,使用http://www.ambion.com的靶位点筛选和设计工具,选取4个siRNA序列(siRNA95、siRNA179、siRNA218和siRNA294),利用一步PCR法产生包含U6启动子的短发夹RNA表达盒技术快速筛选高效siRNA,PCR法制备的shRNA表达盒(PCR-shRNA95、PCR-shRNA179、PCR-shRNA218和PCR-shRNA294)分别与表达N-EGFP融合蛋白的重组质粒pEN-ORF7共转染至293T细胞,48 h后荧光显微镜下检测细胞表达EGFP阳性率,筛选有效siRNA片段,将筛选的PCR-shRNA179的PCR产物转染N-EGFP融合蛋白稳定表达293T细胞系和PRRSV感染的Marc-145细胞,结果表明PCR-shRNA179可明显减少N蛋白的表达、有效减轻PRRSV引起的细胞病变及减少感染PRRSV的Marc-145细胞中的N蛋白阳性细胞。本研究证明一步PCR扩增shRNA表达盒法可用于筛选特异性基因表达抑制的siRNA。

靶向生存素基因的shRNA抑制膀胱癌细胞裸鼠移植瘤生长

目的观察稳定转染靶向生存素（survivin）基因短发夹RNA（shRNA）对膀胱癌细胞裸鼠移植瘤生长的影响。方法将靶向生存素基因的shRNA真核表达载体转染人膀胱癌细胞T24并获得稳定的单克隆细胞,实时定量PCR检测转染后生存素mRNA表达的变化;分别将转染和未转染细胞种植于裸鼠皮下,观察肿瘤生长情况;通过免疫组化检测肿瘤组织生存素蛋白表达的差异。结果RNA干扰使T24细胞生存素表达下调92.86%;未转染组在20～29d均形成体积超过2000mm3的肿瘤,转染组在43d时经病理证实3只裸鼠形成肿瘤,最大体积62.5mm3;免疫组化显示转染组形成的肿瘤生存素蛋白表达明显减弱。结论靶向生存素基因的shRNA明显下调了生存素表达,并抑制了膀胱癌细胞T24裸鼠移植瘤的生长。

转录因子c-Ets-2 shRNA构建和对细胞促凝活性的影响

目的:构建转录因子c-Ets-2的短发夹状双链RNA(shRNA)干扰质粒,验证其对转录因子c-Ets-2表达的干扰效果,并研究转录因子c-Ets-2对人凝血酶原酶(hfgl2)基因表达及细胞促凝活性的影响。方法:采用基因克隆方法构建c-Ets-2 shRNA干扰质粒,并使用酶切鉴定方法和测序进行证实。使用实时荧光定量逆转录PCR(qRTPCR)和Western blot方法对干扰效果进行验证。并进一步采用该质粒与HBV病毒蛋白表达质粒共转染单核细胞系THP-1,研究c-Ets-2 shRNA干扰质粒对hfgl2基因转录表达的影响和对细胞促凝活性的作用。结果:c-Ets-2 shRNA干扰质粒构建成功,可下调转录因子c-Ets-2 mRNA和蛋白水平的表达。当与HBx病毒蛋白表达质粒共转染时,该干扰质粒可抑制hfgl2基因的转录,降低细胞的促凝活性。结论:转录因子c-Ets-2与凝血级联途径有关,参与了重型肝炎和肝细胞癌等疾病的发生发展。

MDR1基因shRNA真核表达质粒的构建

为了构建靶向MDR1基因的短发夹RNA(shRNA)真核表达重组质粒,试验针对MDR1基因序列选取3个干涉靶点,设计合成3条编码shRNA的DNA模板,分别定向克隆到真核表达质粒pSilencer 3.1-H1中构建重组质粒,再进行菌落PCR扩增和测序鉴定。结果表明:菌落PCR扩增得到与预期大小相同的阳性带,经DNA测序证实插入片段完全符合设计要求,序列无突变。说明成功构建了3个靶向MDR1基因的真核表达重组质粒pSilencer 3.1-H1 shRNA。

大鼠STAT3特异性shRNA慢病毒载体的构建与鉴定

目的在已经成功构建4个针对STAT3的shRNA质粒表达载体的基础上,筛选出干扰效果最佳者进行慢病毒包装并鉴定。方法将STAT3的干扰质粒shRNA1、shRNA2、shRNA3、shRNA4及Control1(空载体对照),Control2(无效shRNA对照)分别转染目的细胞(大鼠肾小球系膜细胞),48h后收集细胞提取mRNA,以RT-PCR检测各组分STAT3表达量。对于筛选所得干扰效果最佳的质粒,采用pPACKH1TM慢病毒载体系统进行病毒包装。利用绿色荧光蛋白作为报告基因,对感染效率及病毒滴度进行检测。结果 RT-PCR检测结果显示,shRNA3样品受干扰的效果最佳。成功构建了慢病毒载体Lenti-shRNA3,共转染293T细胞24h、48h,荧光显微镜下可见强绿色荧光,细胞生长状态良好,表明病毒包装成功。转染HT1080细胞,收集慢病毒液,测定病毒滴度为3.34×108ifu/ml,适合感染目的细胞。结论成功构建了STAT3基因的shRNA慢病毒表达载体,为进一步应用奠定了基础。

MeCP2特异性shRNA真核细胞表达质粒的构建与鉴定

目的构建MeCP2特异性SiRNA表达质粒pSilence-MeCP2。方法根据人MeCP2mRNA序列设计作用靶序列,化学合成两条互补的DNA寡核苷酸链,该序列中包含靶序列正义链、反义链,两者间的连接序列及与质粒相匹配的酶切位点序列,连接质粒后转化感受态细胞(E.Coli),使其在大肠杆菌内大量复制,提取质粒,PCR鉴定。结果合成的寡核苷酸序列与要求的序列完全相符,且以正确的方向插入。结论成功构建两个MeCP2特异性SiRNA表达质粒psilence-MeCP2/Ⅰ和psilence-MeCP2/Ⅱ。

针对人蛋白激酶CK2α亚基的shRNA表达质粒的构建与鉴定

目的:构建针对人蛋白激酶CK 2α亚基的shRNA表达质粒。方法:以mU 6pro为载体,化学合成shRNA表达模板,并定向克隆到载体的U 6启动子下游,琼脂糖凝胶电泳法筛选阳性克隆,基因测序法检测插入模板序列的正确性。结果:获得了正确的重组质粒,插入的转录模板序列完全正确。结论:成功构建了针对人蛋白激酶CK 2α亚基的RNA i体系。

慢病毒介导的靶向c-Met可诱导shRNA稳定乳腺癌MDA-MB-231细胞系的构建及生物活性鉴定

目的:探讨适当敲除c-Met后对乳腺癌MDA-MB-231细胞增殖的影响。方法:设计3条针对c-Met基因不同位点的短发夹RNA(shRNA)片段,将其连接到TA载体上,瞬时转染MDA-MB-231细胞,采用RT-PCR、Western印迹检测c-Met mRNA及蛋白表达情况,挑选沉默效率最佳的shRNA。以scramble为阴性对照,MDA-MB-231细胞为空白对照,挑选沉默效率最佳的TA-shRNA,并将其与pSD400慢病毒载体连接,利用293T细胞进行慢病毒组装,收集病毒液并感染MDA-MB-231细胞,将嘌呤霉素与MDA-MB-231细胞共培养,筛选稳定表达shRNA的细胞株。利用多西环素对稳定细胞系进行诱导,Western印迹检测稳定细胞系c-Met蛋白的表达量,MTT法检测敲低c-Met对稳定细胞系增殖的影响。结果:测序结果表明模板序列与设计序列正确,并筛选出沉默效率最高的shRNA为shRNA1,慢病毒包装后筛选出稳定细胞株,适当敲除MDA-MB-231细胞c-Met基因后细胞的增殖明显低于对照组。结论:构建了针对c-Met基因可诱导shRNA的乳腺癌稳定细胞系,为探讨适当敲除c-Met基因后乳腺癌细胞对化疗、放疗敏感性检测奠定了基础。

EPCR基因mRNA在人胃癌细胞系中的表达及其shRNA干扰载体内源性筛靶研究

目的检测人胃癌细胞株中内皮细胞蛋白C受体(endothelial protein creceptor,EPCR)基因的mRNA表达水平,构建EPCR基因特异的短发夹RNA(shRNA)干扰载体,并通过内源性筛靶实验检测EPCR mRNA表达,筛选出最佳的干扰靶序列。方法通过逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)及蛋白免疫印迹(Western blot)检测胃癌细胞系(SGC7901、MGC803、HGC27、AGS)中EPCR mRNA和蛋白的表达,筛选出EPCR高表达的细胞株;设计5对EPCR基因特异性短发夹RNA(shRNA)干扰片段pGPH1/GFP/Neo-EPCR,用Lipofectamine 2000将pGPH1/GFP/Neo-EPCR转染入EPCR高表达的人胃癌细胞,以pGPH1/GFP/Neo空载体作对照;转染后通过观察绿色荧光蛋白来判断转染的效率,选出最优质粒/脂质体比;转染后收集样本,采用RT-PCR及Western blot进行检测,筛选出有效的干扰片段。结果 EPCR在MGC803细胞中表达量最高;最佳质粒:脂质体比值为1μg︰1μL;pGPH1/GFP/Neo-EPCR-homo-555为最有效的干扰质粒。结论成功筛选出针对EPCR基因特异的shRNA干扰载体,转染细胞后可下调EPCR的表达,为进一步研究EPCR的功能和肿瘤的基因治疗奠定了基础。

β-catenin特异性抑制剂XAV939对套细胞淋巴瘤Jeko-1细胞增殖抑制的实验研究

目的:通过短发夹RNA(shRNA)干扰β-catenin基因的表达及使用β-catenin特异性抑制剂XAV939作用于套细胞淋巴瘤(MCL)Jeko-1细胞株,了解特异性抑制β-catenin活性对Jeko-1细胞增殖及细胞凋亡的影响。方法:将构建β-catenin shRNA真核表达载体转染Jeko-1细胞,应用RT-PCR和Western blot的方法鉴定干扰效果,用不同浓度XAV939处理MCL细胞株Jeko-1;应用MTT法绘制细胞生长曲线,流式细胞术分析细胞凋亡,Western blot检测凋亡相关蛋白BCL-2、BAX、Cyclin D1、C-MYC、caspase-3表达水平的变化。结果:shRNA转染48 h后,RTPCR、Western blot检测发现,Jeko-1细胞的β-catenin的mRNA、蛋白表达下降;无论使用shRNA或抑制剂处理,均可抑制Jeko-1细胞增殖,促进其凋亡;Western blot检测显示,凋亡相关蛋白BCL-2、Cyclin D1、C-MYC的表达下降,而BAX、caspase-3表达上升。结论:特异性抑制β-catenin活性能有效地抑制Jeko-1细胞的增殖,并诱导细胞凋亡。

激活转录因子2对胰腺癌细胞增殖与凋亡的影响

目的观察激活转录因子2(ATF2)在胰腺癌细胞中的表达水平,探讨ATF2与胰腺癌细胞增殖和凋亡的关系。方法采用实时PCR和Western blotting检测14例胰腺癌和对应癌旁组织中ATF2 mRNA及蛋白的表达情况;构建ATF2 shRNA转染胰腺癌细胞株,检测转染后胰腺癌细胞的增殖及凋亡情况。结果在胰腺癌组织中ATF2 mRNA及蛋白表达水平高于癌旁组织(P<0.05),p-ATF2蛋白表达水平高于癌旁组织(P<0.01)。与对照组相比,ATF2 shRNA转染的胰腺癌细胞增殖被抑制,凋亡增加(P<0.01)。结论在胰腺癌细胞中ATF2表达水平增高,ATF2 shRNA转染胰腺癌细胞后,明显抑制细胞增殖,增加细胞凋亡。

有效PGK1短发夹RNA序列的筛选

目的筛选有效抑制磷酸甘油酸激酶1(PGK1)基因的短发夹核糖核酸(shRNA)序列。方法针对PGK1的不同基因区域设计4个shRNA序列,应用LipofectamineTM2000方法转染至胶质瘤细胞株U251细胞,荧光显微镜下观察shRNA的转染效率。采用RT-PCR方法检测PGK1的mRNA表达,Western blot方法检测PGK1的蛋白表达。结果针对PGK1-homo-441位点的shRNA4(5′-GCAAGGATGTTCTGTTCTTGA-3′)能更有效地抑制PGK1的mRNA及蛋白表达。结论shRNA4是能有效抑制PGK1表达的序列,可用于PGK1的功能研究。

短发夹RNA表达载体对2型单纯疱疹病毒UL54基因的干扰效应

目的研究短发夹核糖核酸(shRNA)表达载体对2型单纯疱疹病毒(HSV-2)UL54基因的干扰效应。方法针对HSV-2 UL54基因,构建5个靶向HSV-2 UL54基因的短发夹RNA重组表达载体(shRNA1081、shRNA1092、shRNA1276、shRNA1407、shRNA1508),同时设计不针对任何基因的序列为阴性对照组(阴性对照组)及不加任何重组表达载体的空白对照(空白对照组)。重组表达载体通过脂质体转染人胚胎肾细胞(HEK293)后接种HSV-2,48 h后利用荧光定量RT-PCR检测各组细胞UL54 mRNA的表达水平,终点滴定法测定HSV-2子代病毒滴度。结果荧光定量RT-PCR结果示,与空白对照组相比,shRNA1081、shRNA1407和shRNA1508能够降低HSV-2 UL54 mRNA的表达水平(P均<0.01);对UL54基因的抑制率在阴性对照组(加shRNA NC)、shRNA1081组、shRNA1407组、shRNA1508组分别为7%、69%、56%及55%,以shRNA1081组为最高。终点滴定法结果示,与空白对照组比较,shRNA 1081组、shRNA 1407组、shRNA 1508组病毒滴度不同程度下降(P均<0.01)。结论成功构建UL54 shRNA重组表达载体,shRNA1081、shRNA1407、shRNA1508能在体外细胞水平上不同程度地干扰HSV-2 UL54基因表达,从而抑制HSV-2在HEK293细胞中的复制。

敲减BMI-1表达诱导HeLa细胞G_1期阻滞

B细胞特异性莫洛尼氏白血病毒插入位点1(B-cell specific moloney leukemia virus insertionsite1,BMI-1)在多种恶性肿瘤中高表达.为探索BMI-1在宫颈癌发生发展过程中的生物学作用,将构建成功并已鉴定为有效序列的短发夹状RNA(short hairpin RNA,shRNA)真核表达载体BMI-1shRNA2和BMI-1shRNA4,转染人宫颈癌细胞系HeLa并筛选稳定转染细胞株,Western印迹检测BMI-1蛋白表达,实时荧光定量RT-PCR检测周期素依赖性激酶抑制剂p16INK4a(cyclin-dependentkinase inhibitor p16INK4a)、人类端粒酶逆转录酶(human telomerase reverse transcriptase,hTERT)、同源盒A9(homeoboxA9,HOXA9)、同源盒B4(homeoboxB4,HOXB4)和同源盒C13(homeoboxC13,HOXC13)基因mRNA的表达变化,PI染色流式细胞仪检测细胞周期变化.结果表明,在稳定转染BMI-1shRNA2、BMI-1shRNA4的HeLa细胞中,显著抑制BMI-1蛋白表达,上调p16INK4a、HOXA9和HOXC13三者mRNA表达,而hTERT和HOXB4两者mRNA的表达水平无明显改变,同时G1期细胞增加、S期细胞减少,提示敲减BMI-1表达诱导HeLa细胞G1期阻滞,BMI-1可能是宫颈癌基因治疗的靶分子.

沉默组织因子重组腺病毒的构建和胰岛中沉默效果检测

目的构建复制缺陷型重组腺病毒介导短发夹RNA(shRNA)干扰组织因子(TF)在胰岛表达。方法设计并合成四对单链寡核苷酸(ss oligo),经变性退火为双链寡核苷酸(ds oligo)插入穿梭质粒pENTR/U6载体,测序正确后经脂质体介导入成人胰岛,通过实时定量RT-PCR方法筛选对TF沉默效果最佳穿梭质粒pENTR/U6-shRNA,然后与腺病毒骨架质粒行同源重组,筛选出正确重组子,用293A细胞包装出表达TF-shRNA的复制缺陷型重组腺病毒并测定其病毒滴度,通过实时定量RT-PCR腺病毒沉默TF效果予以检测。结果测序结果提示所构建的pENTR/U6-shRNA质粒正确,并从四对dsoligos筛选出对组织因子沉默效果最佳的穿梭质粒pENTR/U6-shRNA,经同源重组后成功构建了介导shRNA-TF复制缺陷型重组腺病毒。转染胰岛后,通过实时定量RT-PCR方法检测发现shRNA-TF腺病毒感染胰岛后对TF mRNA的沉默效果4d后达最佳效果,为54.29%(P<0.05vsNC)。结论成功构建的介导shRNA复制缺陷型重组腺病毒可以体外抑制胰岛细胞中组织因子的表达。