人EGFL7基因短发夹结构RNA慢病毒载体的构建及鉴定

目的构建人类表皮生长因子域7(EGFL7)基因RNA干扰(RNAi)慢病毒载体。方法将靶向EGFL7基因的短发夹结构RNA(shRNA)表达序列连接到包含U6启动子及绿色荧光蛋白(GFP)报告基因的慢病毒载体pGCL-GFP中,获得重组质粒,命名为pGCL-GFP-vshEGFL7,经多聚酶链反应(PCR)和测序鉴定后,与慢病毒包装质粒pHelper 1.0及pHelper 2.0通过lipofectamine 2000共转染至包装细胞293T,包装产生病毒液,测定其滴度。结果PCR扩增和测序结果证实EGFL7shRNA核苷酸链序列插入正确,包装慢病毒产生病毒悬液的滴度为4.8×107TU/ml。结论成功构建人EGFL7基因shRNA慢病毒载体。

靶向人EGFL7基因的短发夹结构RNA对胶质瘤细胞系U251增殖的影响

目的研究类表皮生长因子域7(EGFL7)基因特异性短发夹结构RNA(shRNA)对胶质母细胞瘤细胞系U251细胞体外增殖的影响。方法在筛选出人EGFL7基因的有效RNA干扰靶序列并设计构建其重组慢病毒表达载体的基础上,感染胶质母细胞瘤细胞系U251细胞,荧光显微镜观察转染效率,实时荧光定量多聚酶链反应和蛋白质印迹分别检测EGFL7基因的mRNA和蛋白表达水平,甲基噻唑基四唑(MTT)法检测其增殖能力。结果 EGFL7基因的特异性shRNA转染U251细胞后,EGFL7的mRNA和蛋白表达水平明显降低;细胞的增殖受到明显抑制。结论 EGFL7基因的特异性shRNA可明显抑制胶质母细胞瘤细胞系U251的增殖,提示EGFL7基因在胶质母细胞瘤细胞的增殖中发挥重要作用。

AKT2基因短发夹结构RNA慢病毒载体的构建及鉴定

目的:构建丝/苏氨酸蛋白激酶2(AKT2)基因RNA干扰(RNAi)慢病毒载体。方法:利用公用网站按照RNAi序列设计原则,设计RNAi靶点序列并合成靶序列的Oligo DNA,退火形成双链DNA,与经MluI和ClaI进行酶切后的PLVTHM载体连接产生shRNA慢病毒载体。应用shRNA慢病毒载体转染293T细胞及U87细胞,测定病毒滴度,流式细胞仪测定U87细胞的转染效率,PCR及Western blot鉴定AKT2基因在U87细胞中的下调作用。结果:成功构建了shRNA-AKT2慢病毒载体,经测序与设计合成的靶向链完全一致。荧光显微镜下观察293T细胞感染效率大于90%,病毒滴度为3.59×107TU/ml;流式细胞仪测定对AKT2细胞的转染效率为86.93%。PCR测定shRNA载体感染U87细胞后AKT2的干扰效率为68%。Western Blot结果显示该慢病毒载体对AKT2的表达有较为显著的敲减作用。结论:成功构建了人胶质瘤细胞株AKT2基因RNAi慢病毒载体,为后续的体内外功能学试验创造了条件。

重组人组织因子RNA干扰穿梭载体的构建及其体外鉴定

目的利用RNA干扰(RNAi)技术,以人组织因子(TF)基因为靶基因,构建携带发夹结构的TF-shRNA的穿梭表达载体。方法在以往研究的基础上,设计具有小发夹结构的TF-shRNA序列,经退火后成为互补双链,然后将其克隆至pShuttle Vector1.0-CMV,转化E.coli DH5a菌株,提取重组穿梭质粒行酶切鉴定和测序,RT-PCR法检测其沉默TF基因的效果。结果成功构建了携带TF-shRNA的穿梭表达载体,经限制性内切酶酶切和测序软件分析证实,与设计序列同源性达98%以上;采用多重比较进行统计学分析结果显示,重组质粒pShuttle-TF-shRNA能显著性降低293细胞中TFmRNA表达,转染后24,48和72h细胞中TFmRNA表达含量显著降低,有统计学意义(P=0.000)。结论成功构建了针对人TF基因的穿梭表达载体,为将TF作为治疗靶点提供了实验基础。

腺相关病毒介导的RNA干扰抑制HeLa细胞中CTCF的表达

目的:利用RNA干扰(RNAi)稳定抑制HeLa细胞中CTCF的表达。方法:构建能够抑制转录因子CTCF表达的短发夹RNA(shRNA)的腺相关病毒载体,重组病毒感染HeLa细胞后挑取单克隆,用Western印迹法和实时荧光定量PCR检测CTCF的表达水平。结果:获得3株CTCF被显著抑制的HeLa细胞株,Western印迹法和实时荧光定量PCR结果均显示CTCF的表达水平被抑制,其中最明显的被下调76%。结论:shRNA病毒表达载体构建成功,HeLa细胞中CTCF的表达可被长期稳定地抑制。

稳定靶向干扰长链非编码RNA BC002811胃癌SGC-7901细胞株的构建

目的 BC002811在胃癌中的生物学功能及其作用机制尚不明确。文中旨在构建长链非编码RNA (lncRNA BC002811的短发夹结构RNA (shRNA)重组慢病毒载体,建立稳定干扰BC002811表达的胃癌SGC-7901细胞株。方法实验根据不同BC002811 siRNA转染人胃癌SGC-7901细胞分为:siRNA-1组(siRNA-1正义链及反义链)、siRNA-2组(siRNA-2正义链及反义链)、siRNA-3组(siRNA-3正义链及反义链)、对照组(siRNA-NC正义链及反义链)。取SGC-7901细胞内对BC002811表达抑制效果最明显的siRNA序列构建shRNA慢病毒载体,定义为shRNA组。包装重组慢病毒及测定滴度,建立稳定靶向干扰BC002811表达的SGC-7901胃癌细胞株,MTS法检测细胞增殖能力。结果 siRNA-1组SGC-7901细胞内BC002811的RNA干扰效率较其他组升高。因此,后续实验选择siRNA-1设计BC002811 shRNA。对照组、shRNA组的病毒滴度分别为4.5×108、3.7×10~8TU/mL,提示病毒已包装成功。shRNA组BC002811表达水平[(10%±1%)]较对照组明显降低[(100%±4%)],差异有统计学意义(P<0.01),提示稳定靶向干扰BC002811表达的SGC-7901胃癌细胞株构建成功。与对照组比较,shRNA组的SGC-7901细胞生长速度明显减慢(P<0.05),提示下调BC002811表达可抑制SGC-7901细胞增殖。结论成功建立了稳定靶向干扰BC002811表达的SGC-7901胃癌细胞株,为BC002811在胃癌中的功能及其作用机制研究奠定了基础。

类表皮生长因子域7基因shRNA慢病毒表达载体的构建及鉴定

目的用基因重组技术构建LV3-人类EGFL7基因的小发卡RNA(LV3-h EGFL7-shRNA)慢病毒表达载体。方法设计靶向h EGFL7-shRNA序列,建立LV3-h EGFL7-shRNA,在慢病毒载体p GLV3/H1/GFP+Puro中放置h EGFL7-shRNA基因片段,DNA测序以及酶切的方式进行检测h EGFL7片段,转染293T细胞后对上清液进行浓缩,最后在对病毒滴度进行检测。结果 EGFL7-shRNA核苷酸链有正确的插入顺序,包装慢病毒产生病毒悬液的滴度为2×108TU·m L^(-1)。结论 h EGFL7-shRNA慢病毒表达载体构建成功,鉴定可满足试验需求。