人补体受体1型衍生分子融合基因CR1-SCR2D的构建、表达及生物学活性鉴定

目的构建和表达具有抑制补体生物活性的双功能域人补体受体1型衍生分子CR1-SCR2D。方法基于我室前期工作,将CR1-SCR1-3、人工α螺旋肽段linker、SCR15-17 3个DNA片段依次克隆到改造载体pPIC9k(+)和pPICZαB,构建出表达质粒pPICZαB-CR1-SCR2D;电转化毕赤酵母X-33得到阳性重组子,甲醇诱导目的蛋白CR1-SCR2D表达,SDS-PAGE和Western blot鉴定表达结果;经纯化获得CR1-SCR2D并进行糖基化鉴定后,用CH50和AH50法鉴定目的蛋白在体外抑制补体的生物活性。结果成功构建了目的基因的表达质粒pPICZαB-CR1-SCR2D,基因测序正确;SDS-PAGE和Western blot证实目的基因在毕赤酵母中实现了分泌表达;经镍柱纯化后得到较纯的CR1-SCR2D,糖基化鉴定证明其存在糖基化;CH50法和AH50法结果显示CR1-SCR2D均有较CR1-SCR1-3和CR1-SCR15-17更好的抑制补体生物学活性。结论成功构建了双功能域人补体受体1型衍生分子融合基因CR1-SCR2D,在毕赤酵母中实现了CR1-SCR2D的分泌表达,该融合蛋白对经典/MBL途径及旁路途径补体激活均具有较好的抑制作用。

补体因子H关键结构域野生型及突变型克隆载体的构建表达与功能初探

目的构建并表达补体因子H(complement factor H,CFH)关键结构域蛋白,即野生型短同源重复序列(short consensus repeats,SCR)7和SCR19-20,突变型SCR7 Y402H、SCR19-20 R1210C、SCR19-20 R1215Q,探讨CFH基因突变导致补体过度激活疾病的可能机制。方法采用In-Fusion反应,将编码SCR7(386~446位氨基酸)和SCR19-20(1107~1231位氨基酸)的cDNA序列分别克隆入pET-47b(+)载体,定点突变引入3个预期突变位点Y402H、R1210C和R1215Q,再将携带pET-47b(+)载体6-His纯化标签的CFH-SCR7和CFH-SCR19-20野生型和突变型重组质粒导入穿梭载体pNCMO2,在短芽孢杆菌中进行上述蛋白结构域的表达、Ni-NTA树脂纯化、SDS-PAGE电泳和蛋白质印迹法鉴定。通过检测其与肝素的亲和能力初步鉴定野生型与突变型的功能差异。结果成功构建了CFH关键结构域SCR7和SCR19-20的野生型和突变型重组表达载体pNCMO2-SCR7、pNCMO2-SCR19-20、pNCMO2-SCR7 Y402H、pNCMO2-SCR19-20 R1210C、pNCMO2-SCR19-20 R1215Q。5种重组体均高效表达且经抗6-His抗体和特异性抗CFH单克隆抗体进行蛋白质印迹法实验验证均为相应正确蛋白。SCR7 Y402H比野生型的肝素亲和力强,R1210C和R1215Q均比SCR19-20野生型亲和力弱。结论成功构建并表达了CFH SCR7和SCR19-20突变体,初步鉴定了突变蛋白结构域的功能,为体外进一步研究CFH基因突变致补体过度激活类疾病发生的可能机制奠定了实验基础。

人CR1-SCR2D对脓毒症小鼠炎症损伤的保护作用

目的探讨人补体受体1型双功能域短同源重复序列(CR1-SCR2D)对脓毒症小鼠炎症损伤的保护作用。方法清洁级雄性昆明小鼠随机分为假手术组(40只)、手术组(40只))和保护组(40只)。按参考文献方法构建盲肠结扎穿刺术(CLP)脓毒症小鼠模型,假手术组和手术组小鼠尾静脉注射无菌PBS 0.2 ml,保护组的小鼠注射CR1-SCR2D蛋白(10 mg/kg)。各组留10只小鼠观察手术后96 h生存率。其他小鼠在手术后24 h测定血清C5a、IL-6、TNF-α含量和肺组织MPO含量;免疫组化检测肺组织C4b和C3b的沉积;HE染色观察肺组织病理改变。结果脓毒症组的小鼠48 h后全部死亡,保护组的48 h死亡率为50%,96 h死亡率为80%,生存率显著提高(P<0.05)。脓毒症组的血清C5a、IL-6、TNF-α含量和肺组织MPO含量均明显升高,保护组的显著降低(P<0.05)。脓毒症组肺组织原位C4b和C3b沉积的平均光密度(MOD)值显著升高,保护组的MOD值显著低于脓毒症组的(P<0.05)。病理学检查显示,保护组小鼠肺损伤较脓毒症组的明显减轻。结论补体系统的过度活化在脓毒症的发生和发展中起重要作用,人CR1-SCR2D能明显减轻脓毒症小鼠炎症损伤,具有很好的保护作用。