计算机模拟短小芽孢杆菌木聚糖酶与底物木聚糖的对接

克隆测序短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)木聚糖酶基因,在同源建模所得三维结构的基础上寻找底物结合可能的活性口袋,用计算机模拟其与底物木聚糖的对接,预测酶与催化反应过程的关键氨基酸残基。所得的信息对木聚糖酶的定向改造有重要意义。

以响应面法优化短小芽孢杆菌木聚糖酶产酶条件

应用响应面分析对短小芽孢杆菌木聚糖酶的产酶条件进行优化,得到碳源、氮源及培养时间3种因素交互影响的回归方程.从该方程得到理论最佳产酶条件:培养时间为24h,麸皮、玉米粉、蛋白胨和NH4Cl的质量浓度分别为10,5,5,10g.L-1.在优化条件下,实际最高产酶量为12.1mkat.L-1,与理论最高产酶量12.0mkat.L-1接近,比初始酶活提高12.2倍.

耐碱性短小芽孢杆菌木聚糖酶在枯草杆菌中的表达及发酵条件优化

研究耐碱性短小芽孢杆菌木聚糖酶在枯草芽孢杆菌中异源表达。从耐碱性木聚糖酶高产短小芽孢杆菌BYG5—20中克隆得到带有自身启动子的木聚糖酶基因xynA，将其构建在大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭载体pGJ148中得到重组质粒pGJ148-xynA。采用电转化法将重组质粒pGJ148-xynA转入枯草芽孢杆菌1A747中，得到重组菌电．GJ148-xynA，然后进行诱导表达以及培养基的优化。重组菌GJ148～xynA发酵上清液中木聚糖酶酶活可达93．32IU／ml。耐碱性短小芽孢杆菌木聚糖酶基因xynA可以在枯草芽孢杆菌中实现异源表达，为枯草芽孢杆菌木聚糖酶分泌表达系统的进一步优化奠定了基础。

短小芽孢杆菌木聚糖酶的同源建模及分子动力学模拟

克隆并测序来源于短小芽孢杆菌的木聚糖酶基因,测定其编码产物的理化性质并鉴定其表达产物为常温酶蛋白.利用同源建模构建出具有较高精度的三级结构模型,并进行优化和评估.利用分子动力学模拟木聚糖酶基因对热不稳定的分子机制,了解影响该酶热稳定性的因素,寻找对热不稳定性的区域.通过与嗜热木聚糖酶比较发现,两者在3个区域的分子动力学行为存在较明显的差异.

短小芽孢杆菌木聚糖酶基因在毕赤酵母中的分泌表达及酶学性质研究

将短小芽孢杆菌HB0 30的内切 1,4 木聚糖酶基因克隆到毕赤酵母表达载体pPIC9k上 ,得到重组质粒pH BM2 2 0 ,将pHBM2 2 0经酶切后分别转化三株毕赤酵母KM71、GS115、SMD116 8,该木聚糖酶基因在三株毕赤酵母中均实现了分泌表达。将重组毕赤酵母KM71(pHBM2 2 0 )、GS115 (pHBM2 2 0 )、SMD116 8(pHBM2 2 0 )分别诱导产酶 ,对重组酶进行相关的酶学性质分析表明 ,三者的最适反应pH值约为 5 5 ,最适反应温度约为 6 0℃。在其最适反应条件下测得三者粗酶液酶活分别为 10 80IU mL ,11 6 3IU mL ,9 6 8IU mL。重组毕赤酵母KM71(pHBM2 2 0 )所产酶的热稳定性较好 ,而在pH稳定性方面三者没有太大的差异。

响应面法模拟优化蜡样芽孢杆菌W-3菌株产木聚糖酶发酵条件

【目的】应用响应面法对产木聚糖酶的工艺进行优化,为进一步大规模生产提供参考依据。【方法】通过单因素试验分别考察碳源、氮源、pH、温度、接种量和转速6个因素对蜡样芽孢杆菌W-3产木聚糖酶的影响。通过Design Expert 10.0.3软件中的Box-Behnken进行响应面优化设计。通过对小麦麸皮、氯化铵、pH、温度、接种量和转速进行不同组合,系统地优化了发酵条件。利用二次响应面回归方法建立酶产量与各因素之间的数学模型,并通过回归分析确定各因素对酶产量的影响程度。【结果】小麦麸皮添加量、氯化铵添加量、pH和温度是影响发酵的主效应因素,单因子优化显示,蜡样芽孢杆菌W-3发酵产木聚糖酶条件为小麦麸皮35 g/L、氯化铵5 g/L、pH 8.0、温度70℃、接种量2%、转速210 r/min。在单因子优化的基础上进一步应用响应面优化,找到了更优的发酵参数,经过优化后的发酵条件为小麦麸皮33.0 g/L、氯化铵5.1 g/L、pH 8.3、温度73℃、接种量2%、转速210 r/min,该条件下蜡样芽孢杆菌W3发酵产生的木聚糖酶的酶活为523.24 U/mL。【结论】本试验通过响应面法优化了蜡样芽孢杆菌W-3发酵条件,在33.0 g/L小麦麸皮、5.1 g/L氯化铵、pH 8.3、73℃、2%接种量、210 r/min条件下,可获得较高的木聚糖酶的酶活(523.24 U/mL),比优化之前(225.53 U/mL)提高了2.32倍。

短小芽孢杆菌A-30耐碱性木聚糖酶基因的分子生物学研究

采用PCR方法对短小芽孢杆菌A - 30菌株的耐碱性木聚糖酶基因进行克隆 .在木聚糖选择平板上用刚果红染色法筛选出阳性克隆 ,提取阳性克隆的重组质粒进行酶切鉴定和测序 .该基因在大肠杆菌中表达 ,过夜培养物胞外、胞内和周质空间的木聚糖酶酶活分别为 0 .15 9IUmL-1、0 .32 2IUmL-1和 0 .0 0 7IUmL-1.此木聚糖酶表现出较宽的pH作用范围 ,最适作用pH 7左右 ,在pH 9时仍有 6 0 %以上的酶活性 .图 4参

耐碱性木聚糖酶基因在短小芽孢杆菌中高效分泌表达的研究

从木聚糖酶高产短小芽孢杆菌 (Bacilluspumilus)BP5 1中克隆得到木聚糖酶基因xynA ,将其构建在芽孢杆菌表达载体pWH1 5 2 0中得到重组质粒pWSX1 1。xynA由木糖诱导xylA启动子调控xynA表达。采用同源高效表达策略 ,以原生质体转化方法将pWSX1 1转回原始菌株BP5 1中 ,获得重组菌株BPX1 1。通过木糖诱导重组菌株中的xy nA基因高效分泌表达 ,使木聚糖酶产酶活力比原菌株BP5 1提高了 87% 。

短小芽孢杆菌A-30耐碱性木聚糖酶的纯化及性质研究

The extracellular xylanase from the crude culture filtration of Bacillus pumilus A 30 was purified by ammonium sulfate fractionation,CM Sephadex C 50,DEAE Sephadex A 50 and Bio gel P 30 chromatographies.SDS PAGE analysis indicated that the xylanase had molecular weight 23 kD.Its isoelectric point p I 8.5 was determined by IEF PAGE.Its temperature optima for the activity and its optimum pH was 50℃ and 7.5 respectively.It was stable in a broad pH range and showed good stability below 50℃。Its activity was strongly inhibited by Ag +,Cu 2+ ,Fe 3+ ,Co 2+ ,Hg 2+ ,Zn 2+ ,Al 3+ and increased dramatically by Mg 2+ ,Ca 2+ .Its K m and V m were 7.42 mg·ml -1 and 654 μmol·min -1 ·mg -1 respectively.

稀土选育枯草芽孢杆菌1.108高产木聚糖酶菌株的研究

论文考察了稀土离子对枯草芽孢杆菌1.108液态发酵产木聚糖酶的影响,以期选育高产木聚糖酶的枯草芽孢杆菌。结果表明,于0~6 h时添加1×10^(-4) mol/L的Er^(3+),30℃液态发酵12 h,木聚糖酶活达到133.79 U/mL,获得一株木聚糖酶高产菌Bacillus subtilis X-Er,与原始菌株相比提高10.48%;连续传代培养8次,木聚糖酶活力没有显著变化,表明菌株具有良好的遗传稳定性;电镜结果发现Er^(3+)的加入使该菌细胞壁的通透性增大,推测这可能是木聚糖酶活增加的原因之一。

短小芽孢杆菌固态发酵生产木聚糖酶的培养条件优化

采用单因素试验和正交试验的方法研究了短小芽孢杆菌固态发酵生产木聚糖酶的培养条件,确定了利用麸皮作为在主要基质进行固态发酵生产木聚糖酶的适宜条件:pH 9、温度35℃、料液比1∶2、接种量10%。在500mL三角瓶中固态培养72h左右,木聚糖酶的活力可达4915U/g干曲。

芽孢杆菌木聚糖酶的发酵条件研究

本文研究了芽孢杆菌L23产木聚糖酶的时间曲线,碳源,氮源种类和浓度,添加物,发酵起始pH以及接种量对产酶的影响。该菌经37℃培养50小时,酶活力为30IU/ml,酶最适反应温度为57℃,最适pH值为7.0。

短小芽孢杆菌β-1,3-1,4-葡聚糖酶基因克隆、表达及其酶特性研究

提取短小芽孢杆菌(Bacilluspumilus)基因组,通过PCR克隆了短小芽孢杆菌β-葡聚糖酶基因全长序列.结果表明:该基因全长754bp,ORF为717bp,编码239个氨基酸,计算分子量为26.98kD,等电点为6.08.经Blast分析,该序列与地衣芽孢杆菌同源性最高(91%),该基因首次在GenBank上登录(登录号AY164456).在克隆载体上亚克隆基因全长,构建重组表达载体pET-pum,导入大肠杆菌BL21中表达.SDS-PAGE电泳表明:在27kD左右有表达带,酶活较低(7.24U/mL),仅为出发菌酶活的16%,其最适温度为50℃左右,最适pH在5左右.

芽孢杆菌A-30碱性木聚糖酶用于麦草浆酶法改性的研究

从碱性土壤中分离得到一株耐碱性β-1，4-聚糖酶高产细菌A-30，经初步鉴定属短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus）。采用麸皮为主要碳源，尿素为主要氮源，在pH值8．0、温度32℃，发酵至一定时间，最高木聚糖酶活可达400IU／mL，纤维紊酶活可达0．60IU／mL以上。探讨了用其所产木聚糖酶处理漂白麦草浆以改善其性能的可能性。结果表明，A-30粗酶液可以改善草浆的滤水性、强度和脆性，最适宜的酶用量为2—5IU／g浆。

短芽孢杆菌耐碱性木聚糖酶(xylB)的分子生物学研究

根据已发表的环状芽孢杆菌(Bacillus circulan)和枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)木聚糖酶基因序列设计引物,首次扩增出短芽孢杆菌(Bacillus brevis)中的-β1,4-内切木聚糖酶(以下简称木聚糖酶,E.C.3.2.1.8)基因片段。序列分析表明,该基因与已登录的木聚糖酶基因AF490979.1和AF490980.1分别有97%和96%的同源性,与其它芽孢杆菌属的同源性也较高。将此基因片段插入表达载体pET-30a(+)构建重组质粒,转化大肠杆菌E.coliBL21(DE3)。重组基因工程菌破碎后进行SDS-PAGE电泳检测,结果表明,IPTG诱导后,木聚糖酶基因在大肠杆菌的胞内获得高效表达,且酶活力最高可达26.14 U/mL。重组木聚糖酶最适温度为50℃,最适pH为9.0。

环状芽孢杆菌果胶酶及木聚糖酶活性测定条件优化

为探明环状芽孢杆菌果胶酶及木聚糖酶的催化特性,更好发挥它们的催化性能,从pH值、温度、底物浓度、反应时间、离子浓度几个方面研究了环状芽孢杆菌A6中果胶酶与木聚糖酶活性测定的最适方法.结果表明,果胶酶活性测定的最适条件是:0.5%的果胶溶液用pH10.5的0.2mol/L甘氨酸-氢氧化钠缓冲液配制,测定温度45℃,酶反应时间5min;木聚糖酶活性测定的最适条件是:0.8%的木聚糖溶液用pH7.0的0.2mol/L磷酸缓冲液配制,测定温度55℃,酶反应时间10min.

枯草芽孢杆菌内切木聚糖酶的纯化与性质研究

建立了一种快速、简便分离纯化木聚糖酶的方法。采用活性聚丙烯酰胺凝胶电泳和均质提取法相结合 ,从枯草芽孢杆菌 (Bacillussubtilis)固态培养基发酵产物中分离得到了 2种内切木聚糖酶 ,分别定义为xylⅠ和xylⅡ ,它们水解桦木木聚糖的主要产物有木二糖、木三糖和聚合度更高的木聚寡糖 ,没有木糖。SDS PAGE显示内切木聚糖酶xylⅡ为单肽链结构 ,分子质量为 98 8ku。内切木聚糖酶xylⅡ的酶反应最适温度为 5 0℃ ,酶反应的最适 pH为 7 0。Mn2 + 对xylⅡ酶反应具有促进作用 ,将酶活提高了 2 7倍 ,而Fe3+ 对该酶反应起完全抑制作用。

枯草芽孢杆菌分泌表达极耐热木聚糖酶及其酶学性质

为将海栖热袍菌极耐热木聚糖酶基因xyn B（Gen Bank登录号AY340789）在枯草芽孢杆菌Bs916中进行异源分泌表达,并阐明工程菌分泌重组木聚糖酶的酶学性质。克隆极耐热木聚糖酶基因xynB,将其与罗克霉素启动子融合,构建融合质粒载体pXYNB2,将其转化到枯草芽孢杆菌Bs916中,获得重组枯草芽孢杆菌（Bs916/p XYNB2）,并对重组芽孢杆菌分泌表达的极耐热木聚糖酶的酶学性质进行了研究。SDS-PAGE法测定重组枯草芽孢杆菌分泌的蛋白在相对分子质量43 000处有明显的蛋白表达条带。重组木聚糖酶的最适反应p H值为5.0-5.8,重组木聚糖酶的最适反应温度大于或等于100℃,重组极耐热木聚糖酶在pH值4.6-7.8比较稳定,重组木聚糖酶的温度稳定性在90℃下保温2 h后残存酶活83%。可见,生防枯草芽孢杆菌Bs916能有效分泌表达极耐热木聚糖酶,为以后构建多种纤维素和半纤维素在其中的协同表达,拓宽其碳源利用范围奠定基础。

短小芽胞杆菌产碱性木聚糖酶发酵条件的研究

碱性木聚糖酶在碱性条件下催化水解木聚糖,广泛应用于造纸、纺织等领域。着重对短小芽胞杆菌M-11产碱性木聚糖酶的发酵条件进行初步的探索。研究了菌株的生长曲线、确定最佳接种龄为16 h、最佳接种量为1%;确定最适碳源浓度为7%、最适单一氮源为氯化铵、其浓度为1.0%、最适无机盐为氯化铁、其浓度为3 mmol/L;在此基础之上进行6因素3水平的正交试验,确定最适产酶培养基组成:麸皮5%,接种量3%,氯化铵1.2%,氯化铁3.5 mmol/L,硫酸镁0.03%,氯化钠5 mmol/L,磷酸氢二钾0.4%;最适培养条件:接种龄16 h,初始pH 8.0,温度37℃,300 mL摇瓶装液量50 mL,摇床转速220 r/min,发酵周期48 h。通过对发酵条件的优化使发酵液酶活达613 IU/mL。无机氮源为其最适氮源,因此短小芽胞杆菌M-11在碱性木聚糖酶的产品开发上优于短小芽胞杆菌M-26。

产碱性木聚糖酶芽孢杆菌HSⅠ的筛选及发酵条件研究

通过碱性培养基分离到耐碱的芽孢杆菌HSⅠ ,研究了碳源、氮源、培养温度、培养基起始 pH、培养时间、接种量、通气量、添加物对HSⅠ菌产木聚糖酶的影响 ,测定出其产酶最佳培养条件 :麸皮 6 %,(NH4 ) 2 SO4 0 .2 %,NaNO3 0 .4 %,蛋白胨 0 .6 %,起始 pH为 10 .5 ,接种量为 5 %,2 5 0mL三角瓶装液量为 5 0mL。最佳培养温度为 37℃ ,培养时间为 96h。其酶活力最高达 5 4IU/mL。