共表达分子伴侣蛋白提高III型普鲁兰水解酶在短小芽孢杆菌中的分泌表达及发酵优化

本研究旨在通过共表达分子伴侣蛋白以及优化发酵条件来提高III型普鲁兰水解酶(TK-PUL)在短小芽孢杆菌中的分泌表达水平。通过构建共表达TK-PUL和分子伴侣蛋白的多种重组短小芽孢杆菌,并以胞外酶活为指标对其进行筛选,确定最有利于TK-PUL分泌表达的分子伴侣蛋白及对应的重组短小芽孢杆菌。在此基础上采用单因素实验和响应面法优化重组短小芽孢杆菌的发酵条件。结果表明,共表达分子伴侣蛋白PrsA^(Ba)的重组短小芽孢杆菌的胞外酶活达到98.79 U/mL,提高了0.31倍。该重组短小芽孢杆菌的最佳培养基包括19.65 g/L葡萄糖、21.46 g/L酵母提取物、12.01 g/L MgCl_(2)·6H_(2)O、9.02 g/L脯氨酸、0.01 g/L FeSO4·7H_(2)O、0.01 g/L MnSO4·4H_(2)O、0.001 g/L ZnSO4·7H_(2)O。在发酵温度为35℃、起始发酵pH为7.0的条件下,该重组短小芽孢杆菌于最佳培养基中培养66 h时,其胞外酶活达到192.68 U/mL,提高了1.56倍。本研究通过共表达分子伴侣蛋白和发酵优化实现了TK-PUL在短小芽孢杆菌的高效分泌表达,为TK-PUL的应用提供了基础。

短小芽孢杆菌对羔羊肠道炎症和屏障功能的影响

【目的】本试验旨在研究短小芽孢杆菌对羔羊生长性能及腹泻、血清指标、结肠组织形态、炎性细胞因子和紧密连接蛋白含量的影响。【方法】选取36只初生重3 kg左右的1日龄萨能奶山羊公羔,随机分为4组(每组9个重复,每重复1只羔羊);每天分别饲喂0(CON组)、1 mL(BP1组)、5 mL(BP5组)、10 mL(BP10组)短小芽孢杆菌菌液,其活菌数为1×10^(8) CFU/mL,试验期14 d。【结果】饲喂短小芽孢杆菌对羔羊末重、平均日增重、平均日采食和料重比均无显著影响(P> 0.05),但均降低了羔羊的粪便评分和腹泻频率(P <0.05);BP1组血清中谷草转氨酶含量低于对照组(P <0.05),二胺氧化酶含量低于对照组和BP5组(P <0.05),与对照组相比,其它三组均降低了D-乳酸含量(P <0.05);BP1组增加了结肠肌层厚度(P <0.05);与对照组相比,BP1组、BP5组和BP10组均降低了IL-1β、IL-6、TNF-α含量(P <0.05),增加了IL-10、TGF-β、IFN-γ、PPAR-γ的含量以及MUC2、Claudin-1、Claudin-4、Occludin和ZO-1的含量(P <0.05),而且减少了结肠组织中性粒细胞细胞浸润。【结论】在初生羔羊代乳粉中添加短小芽孢杆菌可以降低羔羊腹泻频率,改善结肠组织形态,缓解炎症反应,增强黏膜屏障功能,但对生长性能无显著影响。

短小芽孢杆菌(GXUN613L)对银鲑生长、血清生化指标、抗氧化能力及肠道健康的影响

试验旨在探讨短小芽孢杆菌(GXUN613L)对银鲑生长性能、血清生化指标、抗氧化能力及肠道健康的影响。挑选240尾初始体质量为(130.2±10.1) g的银鲑,随机分为4组,每组3个重复,每个重复20尾鱼。CK组、LL组、LM组和LH组分别在基础饲料中添加0、2×10^(7)、4×10^(9)、8×10^(11) CFU/g的短小芽孢杆菌(GXUN613L)。试验期6 w。结果显示,LL组和LM组银鲑的增重率、特定生长率显著高于对照组(P<0.05);LM组银鲑的蛋白质效率显著高于对照组(P<0.05),饲料系数显著低于CK组(P<0.05)。LL组、LM组和LH组银鲑血清中的总蛋白、白蛋白和总胆固醇含量均显著高于CK组(P<0.05),LM组银鲑血清中葡萄糖含量和碱性磷酸酶活性显著高于CK组(P<0.05)。LM组银鲑肝脏的总抗氧化能力、过氧化氢酶、超氧化物歧化酶及谷胱甘肽过氧化物酶活性显著高于CK组(P<0.05)。LM组银鲑前肠、后肠肌层厚度及绒毛高度显著高于CK组(P<0.05),肠道微生物多样性更好。研究表明,饲料中添加短小芽孢杆菌(GXUN613L)可以促进银鲑生长,改善银鲑血清生化指标及肠道健康,提高银鲑的抗氧化能力,其适宜添加量为4×109 CFU/g。

稻瘟病拮抗菌短小芽孢杆菌NDY-10的功能特性与全基因组分析

短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)NDY-10对植物病原菌具有广谱拮抗活性,其中对稻瘟病菌的抑菌率最高。从NDY-10菌株对稻瘟病菌的拮抗特性和全基因组分析2个方面进行研究,结果表明,NDY-10菌株对稻瘟病病菌具有非常强的抑制作用,其无菌发酵液对稻瘟病菌的抑制率可达100%,且与添加量呈正相关。NDY-10菌株无菌发酵液对温度、紫外线辐射不敏感,强酸或强碱会影响其拮抗活性。经3种蛋白酶处理后,NDY-10菌株对稻瘟病病菌的抑制率下降,说明短小芽孢杆菌NDY-10菌株对稻瘟病病菌的拮抗物质是一种蛋白。NDY-10菌株的完整基因组大小为3736781 bp(含41.63%的G+C),包括3893个编码序列(CDS)。从该基因组中鉴定出9条基因簇,其中大部分负责抑制代谢物的合成,并且发现了tasA拮抗基因(801对碱基)。根据之前的研究,推测其为稻瘟病接抗菌NDY-10菌株的关键功能基因。由本研究结果可知,NDY-10菌株可以作为潜在的优秀的生防制剂用于防治稻瘟病。

短小芽孢杆菌防治植物病害研究进展

过度使用化学农药导致植物抗耐药性加重、农产品污染、环境残毒等一系列化学农药综合症,利用生物农药替代化学农药防治植物病害是大势所趋。短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)具有抵抗环境胁迫能力强、分泌多种抗菌类物质以及广泛的生物防治特性,是芽孢杆菌属中最有价值的成员之一,具有作为生防微生物开发成绿色农药的商用潜力。目前,短小芽孢杆菌INR7、HR10、SE34、SE49、SE52、KUDC1732、MCB-7、PTB180、RST25等均已被广泛报道,可通过多种机制拮抗真菌植物病原菌。本文归纳了短小芽孢杆菌的主要次生代谢物及抑菌功能基因种类,阐述了相关菌株拮抗植物病菌的作用机制,综述了其在植物病害生物防治方面的研究成果,以期为短小芽孢杆菌作为生防制剂的研究和应用提供参考。

短小芽孢杆菌过渡态调节因子AbrB的功能特征

【目的】AbrB是枯草芽孢杆菌中重要的过渡态调节因子,在细菌从对数生长期到稳定期的转换阶段发挥作用,但其功能在短小芽孢杆菌中知之甚少,故进一步探究其调控作用。【方法】为了解AbrB在短小芽孢杆菌中所参与的生物学功能,利用具有反向选择标记的温度敏感型质粒载体在短小芽孢杆菌SCU12中对abrB基因进行无痕敲除,获得菌株SCU12(ΔabrB)。为研究敲除菌表型变化,对细菌生长曲线和胞外蛋白酶活性进行测量,观察菌落形态和生物膜形成并利用swarming平板检测其运动性。【结果】获得一株abrB敲除菌株SCU12(ΔabrB)。生长曲线结果显示,与亲本菌株相比,abrB敲除菌株的最高OD_(600 nm)值降低24%,生长受到抑制;肉眼观察菌落形态发现菌落颜色和形态发生改变;运动性实验表明敲除菌株运动性降低;18 h以内敲除菌株生物膜形成时间提前;胞外蛋白酶活性显著增加,是亲本菌株的1.59倍。【结论】abrB基因在短小芽孢杆菌中具有广泛的调节作用。

短小芽孢杆菌CD52富硒条件优化

为了得到能够将无机硒转化为有机硒的菌株,本研究经过多轮筛选,得到一株目的菌株CD52,经多种形式鉴定,最终确定为短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)。对此菌株转化有机硒的发酵条件进行优化,确定在接种量为3.9%、亚硒酸钠浓度为39 mg/L、初始pH为5.6时有机硒转化率最高,可达到96.0%。本研究可以为芽孢杆菌转化无机硒生产有机硒的研究提供参考依据,也为在实际生产中的应用研究提供了参考数据。

短小芽孢杆菌制剂在虾蟹混养池塘中应用影响分析

江苏常州市金坛区、兴化市及建湖县等地在河蟹养殖中,常利用池塘中的丰富水草给蟹提供良好的栖息环境;并将小龙虾与河蟹混养,以充分利用水资源和土地资源,增加农户的经济收入(曹凑贵等,2017)。在虾蟹共作池塘中泼洒微生物复合菌剂是净化水质、提高水产动物免疫力的常见操作(王红强等,2014)。但是近年来在大量施用生物菌剂如多菌发酵剂的虾蟹养殖塘中依然暴发了以弗氏柠檬酸杆菌、嗜水气单胞菌等为致病菌的虾蟹烂鳃、烂眼病症(Liu X等,2020)。

短小芽孢杆菌改善烟叶品质的研究

从烤烟叶面上分离筛选得到一株短小芽孢杆菌Van35(Bacillus pumilus Van35),将其菌剂喷施于烟丝,在45℃,60%温湿度条件下发酵21d。测定了烟丝的总糖、还原糖、钾、纤维素、蛋白质、总氮和烟碱含量。结果表明,处理后的烟丝中总糖、还原糖和钾含量升高,纤维素、蛋白质、总氮和烟碱含量均有所下降。菌剂Van35处理后,烟叶的糖氮比、糖碱比和氮碱比均有提高,化学成分比例更加协调。利用短小芽孢杆菌Van35处理后的烟叶样品,具有明显提调烟香、细腻醇和烟气、降低刺激性、掩盖杂气和改善卷烟吸味的效果。

短小芽孢杆菌AR03对烟草黑胫病菌的拮抗活性及其田间防效

为测定短小芽孢杆菌AR03对烟草黑胫病菌的拮抗作用及其发酵菌剂的田间防效,通过对峙培养法、固态发酵及田间小区试验的方法发现,AR03菌体和发酵液对烟草黑胫病菌具有很强的拮抗活性,而其除菌上清无拮抗活性,初步说明AR03分泌的抗菌物为胞内物质。AR03经固态发酵后的活菌数为3.82×1011cfu/g。该菌剂的田间小区试验结果显示,对混合有青枯病发生的烟草黑胫病的防治效果明显好于对照药剂,且与72%甲霜灵.锰锌可湿性粉剂协同防治效果最好。因此,AR03对烟草黑胫病和青枯病具有可持续控病作用,是1株极具开发潜力的生防菌株。

短小芽孢杆菌A-30耐碱性木聚糖酶基因的分子生物学研究

采用PCR方法对短小芽孢杆菌A - 30菌株的耐碱性木聚糖酶基因进行克隆 .在木聚糖选择平板上用刚果红染色法筛选出阳性克隆 ,提取阳性克隆的重组质粒进行酶切鉴定和测序 .该基因在大肠杆菌中表达 ,过夜培养物胞外、胞内和周质空间的木聚糖酶酶活分别为 0 .15 9IUmL-1、0 .32 2IUmL-1和 0 .0 0 7IUmL-1.此木聚糖酶表现出较宽的pH作用范围 ,最适作用pH 7左右 ,在pH 9时仍有 6 0 %以上的酶活性 .图 4参

短小芽孢杆菌碱性蛋白酶BP的纯化和性质

短小芽孢杆菌产生的碱性蛋白酶BP经CM—Sephadex-C-50和Sephadex-G75两个柱层析,得到了聚丙烯酰胺凝胶电泳纯的酶组分,比活力从1307μ/mg提高到5538μ/mg.活力回收为21%,酶水解酪蛋白的最适反应温度为50℃,最适pH为9.5,Mn^2+、Ca^2+对酶有激活作用,Hg2+、Ag^+对酶有抑制作用.酶的热稳定性不高,但在Ca^2+保护下,热稳定性明显提高.酶的最适作用底物为酪蛋白,对血红蛋白、蛇毒蛋白、牛血清蛋白、卵蛋白、核糖核酸酶也有水解作用.对酪蛋白的Km为0.62%,V_max为50μg/min.DFP可完全抑制酶活性,PMSF和NBS也严重抑制酶活力,PCMB、_o-PTH和EDTA几乎不抑制酶活力.纯酶的分子量为25000Dal.该酶蛋白含有17种氨基酸,其中甘氨酸(Gly)和丙氨酸(Ala)为主要氨基酸.

一株短小芽孢杆菌B1的筛选鉴定及其抗菌特性研究

为筛选抗水产弧菌的益生菌株,自西沙海域采集的珊瑚和海水样品共分离到125株细菌,从中筛选出1株无溶血性且对多株病原菌具有拮抗作用的海洋细菌B1。基于生理生化及16SrDNA序列鉴定海洋细菌B1为短小芽孢杆菌。以副溶血弧菌13150为病原指示菌,用琼脂扩散法测定发酵液抑菌活性,并通过卤虫浸泡方式和药敏试验方法检测短小芽孢杆菌B1的安全性,同时进行温度、酸碱度、盐度的发酵条件优化研究。试验结果显示,短小芽孢杆菌B1对副溶血弧菌、溶藻弧菌、哈氏弧菌等有显著的拮抗作用;共培养试验显示,加入等量短小芽孢杆菌B1无菌上清液可显著抑制副溶血弧菌的生长;安全性试验发现,短小芽孢杆菌B1对卤虫的72h半致死密度为108cfu/mL,副溶血弧菌13150的72h半致死密度为105cfu/mL。此外,药敏试验表明,短小芽孢杆菌B1只对20种常规抗生素中的5种产生抗性;优化后的短小芽孢杆菌B1发酵条件为:温度30℃,pH 7.0,NaCl质量分数为2%。研究表明,短小芽孢杆菌B1具有防治水产养殖病原弧菌的应用潜力。

短小芽孢杆菌β-1,3-1,4-葡聚糖酶基因克隆、表达及其酶特性研究

提取短小芽孢杆菌(Bacilluspumilus)基因组,通过PCR克隆了短小芽孢杆菌β-葡聚糖酶基因全长序列.结果表明:该基因全长754bp,ORF为717bp,编码239个氨基酸,计算分子量为26.98kD,等电点为6.08.经Blast分析,该序列与地衣芽孢杆菌同源性最高(91%),该基因首次在GenBank上登录(登录号AY164456).在克隆载体上亚克隆基因全长,构建重组表达载体pET-pum,导入大肠杆菌BL21中表达.SDS-PAGE电泳表明:在27kD左右有表达带,酶活较低(7.24U/mL),仅为出发菌酶活的16%,其最适温度为50℃左右,最适pH在5左右.

利用短小芽孢杆菌发酵马铃薯渣生产单细胞蛋白饲料的研究

研究以在马铃薯淀粉生产过程中产生的马铃薯渣与汁水为原料,以短小芽孢杆菌ZY05为发酵菌种,优化马铃薯薯渣液态发酵生产单细胞蛋白饲料的工艺。初步确定了马铃薯薯渣与汁水发酵的适宜条件,具体为除菌种外不添加任何外源物质,pH自然,发酵温度为37℃,转数为180r·min-1,发酵时间为120h。通过本项工艺获得的马铃薯渣与汁水发酵产物中单细胞蛋白含量达到19.23%,氨基酸组成均衡,并且经大鼠急性毒理试验证明无毒,经小鼠采食量与增重试验证明均优于同等质量的豆粕。利用短小芽孢杆菌发酵马铃薯渣生产单细胞蛋白饲料具有良好的应用前景。

耐碱性木聚糖酶基因在短小芽孢杆菌中高效分泌表达的研究

从木聚糖酶高产短小芽孢杆菌 (Bacilluspumilus)BP5 1中克隆得到木聚糖酶基因xynA ,将其构建在芽孢杆菌表达载体pWH1 5 2 0中得到重组质粒pWSX1 1。xynA由木糖诱导xylA启动子调控xynA表达。采用同源高效表达策略 ,以原生质体转化方法将pWSX1 1转回原始菌株BP5 1中 ,获得重组菌株BPX1 1。通过木糖诱导重组菌株中的xy nA基因高效分泌表达 ,使木聚糖酶产酶活力比原菌株BP5 1提高了 87% 。

短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus）脱毛蛋白酶基因的克隆与序列分析

短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)UN-31-C-42菌株是从成都市生活垃圾中分离，并经多次诱变后得到的菌株。其发酵液具有很好的脱毛效果，且对皮革胶原没有损伤。通过对该菌株发酵液中的碱性蛋白酶DHAP的纯化与N′-末端氨基酸序列测定，以及对该序列的同源性分析后，设计出相应引物，用PCR方法扩增了该菌株的碱性蛋白酶基因AP。测序结果表明，该克隆基因全长1588bp，有一个全长1149bp的编码区序列，推测蛋白质序列长383个氨基酸残基，成熟肽分子量为27．8kD。推测的成熟蛋白酶N′-末端具有与DHAPN′-末端完全匹配的序列，说明克隆到的基因为脱毛蛋白酶基因。同源性分析表明，该基因序列与已报道的其他碱性蛋白酶基因有较高的同源性。

短小芽孢杆菌转座突变株的GFP标记及在水稻上的定殖

【目的】研究GFP标记的短小芽孢杆菌在水稻植株上的定殖规律,为其生物防治应用提供科学依据。【方法】从短小芽孢杆菌GFP标记的转座突变株库中筛选强表达GFP且遗传稳定的突变株,用作水稻植株的定殖示踪。【结果】采用荧光酶标仪、流式细胞术检测及荧光显微镜观察等手段,对1 467株Tn5-egfp随机插入突变株的GFP表达作了定量和定性分析,最终获得8株荧光表达较强的突变株,并对突变株作了T-DNA插入拷贝数鉴定。在开放和封闭系统中,标记菌在水稻幼苗根际土壤中均可以存活15 d以上,且前者标记菌的数量下降相对更慢。【结论】短小芽孢杆菌在根毛区及侧根分生处的数量最多,并在根表面形成菌膜。该菌可通过水稻幼苗根部的伤口或幼嫩根毛等部位侵入根系,主要分布在皮层细胞及其间隙,在植物的维管束内亦可观察到荧光标记菌。研究结果表明该菌在水稻幼苗根际土壤中有着良好的定殖能力。

短小芽孢杆菌作为芽孢杆菌属基因工程受体菌的研究

以质粒pUB110 DNA转化B. pumilus 289原生质体,转化频率为10^(-3)—10^(-9)与B.tubtilis 168系统相当;但B.pumilus 289原生质体的再生频率(0.3—12.0％)略低于B.subtilis 168(1.53—24.16％);在无选择压力条件下质粒pUB110在B.pumilus 289中经过45个世代周期,自发丢失率小于3％,同于B.subtilis 168系统。外源基因在B.pumilus 289中经25个世代周期丢失率低于5％,而在B.subtilis 168系统中则高达24％;外源基因的表达水平亦高于B.subtilis 168系统。因此,B.pumilus 289是一个值得进一步开发的基因工程受体系统。

短小芽孢杆菌EN16诱导番茄对细菌性青枯病的抗性

采用盆栽试验法研究了短小芽孢杆菌EN16对番茄青枯病的诱导抗病效应.结果表明,菌株EN16诱导番茄产生对青枯病的防病效果达到49.45%-68.89%;分别在挑战接种间隔期为7-10 d、菌株灌根接种2种处理条件下,菌株EN16表现出较好的诱导抗病效果.测定EN16处理对番茄叶片中几种防御酶的影响,结果显示,在病菌挑战接种前后菌株EN16处理均能引起过氧化物酶(POD)、多酚氧化酶(PPO)和苯丙氨酸解氨酶(PAL)等防御酶活性的显著增强.