短干扰RNA特异性抑制哺乳动物β淀粉样前体蛋白裂解酶基因表达

目的:探讨β淀粉样前体蛋白裂解酶(-βsite APP cleav ing enzym e,BACE)的短干扰RNA(short interfering RNA s,siRNA)是否能抑制BACE在哺乳动物细胞中的表达,为阿尔茨海默病(AD)的治疗提供新的手段。方法:采用PCR分别扩增增强型绿色荧光蛋白(EGFP)、U 6启动子和靶向BACE的特异性小干扰RNA(siBACE),随后将相应的序列片段克隆入真核表达载体pLXSN,通过限制性内切酶和测序对该重组表达载体pLXSN/EGFP-U 6-siBACE进行鉴定;制备稳定高表达BACE基因的神经母细胞瘤SK-N-SH细胞株,用荧光显微镜和免疫组织化学的方法观察siRNA对BACE表达的影响。结果:成功构建了靶向BACE的短干扰RNA的逆转录病毒载体pLXSN/EGFP-U 6-siBACE,并能特异性地抑制BACE在神经母细胞瘤SK-N-SH细胞株中的表达。结论:成功构建了针对BACE的短干扰RNA的逆转录病毒表达载体pLXSN/EGFP-U 6-siBACE,并能有效抑制哺乳动物BACE基因的表达,为利用RNA干扰技术作为治疗AD的新方法提供了重要的实验基础。

短干扰RNA抑制人宫颈癌HeLa细胞Ku80基因表达

目的针对内源性Ku80基因序列体外构建短干扰RNA(siRNA)线性DNA转录载体,观察其在细胞内产生的siRNA对该基因表达的影响。方法构建的线性DNA转录载体经脂质体导入宫颈癌HeLa细胞内,转录产生21 bp的短双链siRNA,并用免疫印迹法分析Ku80基因在蛋白水平表达的情况。结果体外成功构建出siRNA线性DNA转录载体LS1/LAS1和LS2/LAS2;载体分别导入HeLa细胞内生成相应siRNA;与空白对照组比较,实验组均能特异性抑制Ku80基因的表达;其抑制效果和时间点与所选基因靶位相关。结论由线性DNA载体转录生成的siRNA在细胞内特异性抑制内源性基因表达,为Ku80用于肿瘤靶向基因治疗提供了一个新的实验依据。

Nucleostemin基因特异性短发夹状干扰RNA在裸鼠移植瘤模型体内的抗白血病作用

目的探讨核干细胞因子(NS)特异性短发夹状干扰RNA(NS-shRNA)在裸鼠移植瘤模型体内的抗白血病作用。方法对数生长期HL-60细胞接种于裸鼠皮下使其致瘤并洗脱,体外传至第5代再次接种裸鼠,Transwell法验证HL-60细胞体外侵袭力,建立高致瘤性HL-60白血病细胞异种移植瘤裸鼠模型。腹腔注射体外合成的NS-shRNA脂质包裹体,观察治疗前后瘤体体积、重量的变化,组织切片、HE染色观察肿瘤细胞学改变,免疫组织化学检测瘤体细胞内NS蛋白含量,TdT介导的dUTP缺口末端标记技术(Tunel)检测细胞凋亡情况。结果制备的高致瘤性HL-60细胞使30只裸鼠均形成异种移植瘤,成瘤率为100%,瘤体大小均一。腹腔注射NS-shRNA脂质包裹体13天后,治疗组裸鼠移植瘤体积增长率为207.1%,阴性和空白对照组分别为497.1%和569.6%。治疗组瘤体重量为(1.18±0.27)g,阴性和空白对照组为(2.04±0.73)g和(2.35±0.41)g。切片观察治疗组有大量斑片状组织结构破坏,并出现"凋亡特征"样细胞改变。免疫组织化学检测治疗组移植瘤细胞NS蛋白阳性率和积分值分别为(71.59±1.80)%和(110.26±13.46),阴性对照组为(90.72±1.47)%和(195.11±9.71),空白对照组为(97.33±1.76)%和(220.93±16.54),与阴性和空白对照组相比,NS蛋白表达抑制率分别为43.5%和50.1%。Tunel法检测治疗组移植瘤内出现较多凋亡细胞。结论 NS-shRNA在裸鼠移植瘤模型体内具有抗白血病作用,其作用机制之一可能是通过下调NS表达诱发白血病细胞凋亡增加。

T7启动子介导体外构建Nucleostem in特异性短发夹状干扰RNA

目的体外构建合成针对Nuc leostem in(核干细胞因子,NS)基因的短发夹状干扰RNA(shRNA),用于进一步研究以该基因为靶目标、RNA干扰(RNA interference,RNA i)为手段的白血病基因治疗可行性。方法从Nuc leostem in基因的三个变异体cDNA共同序列中筛选出2个3′端为AA的21个碱基片段作为shRNA合成的对应序列,9个碱基的5′-UCUCUUGAA-3′作为Loop环。以23个碱基的5-′GGATC-CTAATACGACTCACTATA-3′作为T7启动子(T7 Promoter)序列,构建shRNA的体外合成双链DNA模板,一条链5′端无AA,顺序为启动子、shRNA正义信息链、Loop环、shRNA反义信息链,共70个碱基;另一条是该链的互补链,5′端带有AA,共72个碱基。在T7 RNA聚合酶(T7 RNA polym erase)作用下合成shRNA,纯化后通过凝胶电泳比较灰度值确定shRNA浓度;shRNA作用于HL-60细胞,通过观察细胞形态变化和NS-mRNA抑制率验证干扰效果。结果体外合成的两条shRNA电泳无降解和弥散现象,浓度分别为5.24μmol.L-1和3.35μmol.L-1;干扰HL-60细胞48 h后,细胞密度和聚集程度下降,细胞之间大小相差悬殊,经shRNA-NS-2作用的HL-60细胞一部分由圆形变成了梭形并有明显的伪足;与对照组相比NS-mRNA抑制率分别达到37.82%和71.88%。结论体外成功构建和合成了两条针对Nu-c leostem in基因的shRNA,且抑制该基因表达的作用明显,shRNA-NS-2使HL-60细胞形态发生了改变。所合成的shR-NA-NS-2可作为进一步研究该基因和探索白血病的基因治疗的工具。

手持GPS接收机短多径干扰抑制方法研究

分析了手持GPS接收机在实际应用中定位精度的多径干扰影响因素,提出了短多径干扰抑制算法,并将该算法用于导航接收机中,建立了实现原理框图,进而提出了短多径抑制算法的具体步骤,通过实测检测得到较高的精度。

高频返回散射系统中一种非长干扰的抑制方法

高频返回散射系统工作在HF频段,这一频段电磁环境非常复杂,并且存在各种类型的干扰,这些干扰严重影响了系统的工作性能,必须加以抑制.通过对高频返回散射系统实测数据中存在的干扰进行分析,发现有种干扰在Doppler域相邻Doppler单元以及相邻距离单元均有较强的相关性.针对这种干扰,提出了一种Doppler域基于特征子空间的干扰抑制方法,即在Doppler域构造干扰协方差矩阵,进行特征分解得到干扰子空间,然后将待处理单元的回波向干扰子空间的正交补空间投影,从而将干扰滤除.实测数据处理结果证明了该方法的有效性.

RNA干扰机制的研究进展

RNA干扰(RNAi)广泛存在于各种生物体中,是参与细胞防御与分化调控的重要机制之一。RNAi的作用由双链RNA启动,通过在转录、转录后和翻译等多个水平上对同源基因表达的特异阻断和抑制来实现,清晰地阐明其作用机制将为功能基因组学、发育生物学,以及抗肿瘤、抗病毒的新策略研究提供重要的理论依据。本文综述了近年来有关RNAi机制的研究进展。

RNA干扰——一种有力的基因沉默工具

RNA干扰(RNAi)自从1998年被阐明以来,一直是科学研究的一大热点。短短几年,基于此机制建立的技术,在功能基因组学、微生物学、基因表达调控机制研究等领域得到了广泛应用,已经成为一种有力的基因沉默方法。尤其对非编码RNA中的短干扰RNA与微小RNA的研究日益受到重视。本文从RNAi技术的发展、作用机制及应用等方面进行综述。

干扰RNA沉默HIF-1α在缺氧状态下对骨肉瘤细胞VEGF表达的影响

背景与目的:研究表明H IF-1α是肿瘤适应低氧微环境、诱导血管新生的一个主要调控因子。本研究通过观察体外低氧培养条件下骨肉瘤细胞系SaOS-2中H IF-1α和VEGF的表达,探讨H IF-1α在骨肉瘤缺氧激活血管新生调控途径中的作用。方法:CoCl2化学缺氧法模拟肿瘤缺氧环境。半定量RT-PCR和免疫组化法分别检测不同缺氧时相中H IF-1α和VEGF在m RNA和蛋白水平的表达。构建针对H IF-1α的短发夹状小干扰RNA真核表达载体并转染SaOS-2细胞。免疫印迹沉淀观察转染后H IF-1α的基因沉默效果,RT-PCR和ELISA双抗体夹心法检测H IF-1α短基因沉默后SaOS-2细胞中VEGF的变化。结果:低氧条件下,SaOS-2细胞H IF-1αm RNA水平稳定,蛋白表达显著升高;而VEGF m RNA和蛋白的表达均显著升高。构建的H IF-1α短发夹状小干扰RNA表达载体转染SaOS-2细胞后能够显著下调H IF-1α基因的表达,同时VEGF基因的表达也受到明显抑制。结论:缺氧促使SaOS-2细胞H IF-1α在蛋白水平表达升高,H IF-1α通过转录激活VEGF的机制促进骨肉瘤缺氧状态下的血管新生。

RNA干扰用siRNA的体外转录合成

RNA干扰(RNAinterference,RNAi)作为一种特异性沉默基因表达的方法,正在成为研究基因功能、胚胎发育及病毒性疾病治疗的重要工具,而获得符合干扰要求的短双链干扰RNA(smallinterferenceRNA,siRNA)是进行RNA;研究的首要步骤。本研究建立了体外转录合成siRNA方法,并用其生成的siRNA干扰鸡成纤维细胞外源绿荧光蛋白(GFP)基因和内源3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)基因的表达。结果显示,siRNA能特异性降低鸡成纤维细胞中内外源基因的表达。本实验认为这种以DNA为模板体外转录合成siRNA方法操作简单、成本低、产物得率高,值得从事RNA研究者参考借鉴。

短发夹状RNA特异性抑制HeLa细胞的Hax-1基因表达

目的:构建靶向Hax-1基因的短发夹状干扰RNA(short hairpin RNA,shRNA)表达载体pGenesil-Hax-1,并探讨siRNA靶向抑制Hax-1基因表达的作用。方法:根据shRNA设计的原则,在Hax-1全长序列中选取含19个核苷酸靶序列,设计形成siRNA的DNA模板并克隆到shRNA表达载体pGenesil-1中,获得可靶向抑制Hax-1基因的重组shRNA表达载体。采用LipofectamineTM2000转染试剂将pGenesil-Hax-1导入HeLa细胞中;分别采用RT-PCR以及Western blot从mRNA和蛋白水平上检测干扰效果。结果:半定量PCR及Western blot结果表明,siRNA可使Hax-1mRNA的转录水平得到显著抑制(P<0.01),Hax-1蛋白的表达较对照组减少约70%。结论:靶向Hax-1基因的重组shRNA表达载体pGene-sil-Hax-1介导的siRNA可显著抑制Hax-1基因在人宫颈癌HeLa细胞中的表达。

RNAi干扰对K562细胞表达谱的影响

目的联合运用RNAi技术和cDNA表达谱芯片研究干扰c-myc对K562细胞表达谱的影响。方法经过RT-PCR和流式细胞仪检测,筛选出干扰效果最好的siRNAs,经LipofectamineTM2000脂质体法转染K562细胞,提取总RNA,逆转录为cDNA,荧光标记后与K562表达谱芯片杂交。结果经扫描、分析杂交结果,有455个基因表达下调,有12个基因表达上调。结论基因芯片和RNAi是分析基因功能的有力工具,也是发现新的肿瘤治疗靶标的有效方法。

短发夹状RNA靶向抑制HaCaT细胞Hax-1基因的表达研究

目的观察短发夹状干扰RNA靶向抑制Hax-1基因诱导HaCaT细胞凋亡的作用。方法构建特异性抑制Hax-1的shRNA表达载体并转染HaCaT细胞;分别采用半定量PCR以及Western blot从mRNA和蛋白水平检测干扰效果;流式细胞术检测HaCaT细胞的凋亡。结果 Hax-1基因mRNA水平以及蛋白水平的表达均得到显著抑制,HaCaT细胞凋亡率明显升高。结论靶向Hax-1的shRNA显著抑制了Hax-1基因在HaCaT细胞中的表达,并明显诱导HaCaT细胞凋亡。

重组人组织因子RNA干扰穿梭载体的构建及其体外鉴定

目的利用RNA干扰(RNAi)技术,以人组织因子(TF)基因为靶基因,构建携带发夹结构的TF-shRNA的穿梭表达载体。方法在以往研究的基础上,设计具有小发夹结构的TF-shRNA序列,经退火后成为互补双链,然后将其克隆至pShuttle Vector1.0-CMV,转化E.coli DH5a菌株,提取重组穿梭质粒行酶切鉴定和测序,RT-PCR法检测其沉默TF基因的效果。结果成功构建了携带TF-shRNA的穿梭表达载体,经限制性内切酶酶切和测序软件分析证实,与设计序列同源性达98%以上;采用多重比较进行统计学分析结果显示,重组质粒pShuttle-TF-shRNA能显著性降低293细胞中TFmRNA表达,转染后24,48和72h细胞中TFmRNA表达含量显著降低,有统计学意义(P=0.000)。结论成功构建了针对人TF基因的穿梭表达载体,为将TF作为治疗靶点提供了实验基础。

慢病毒shRNA靶向干扰RegⅣ基因胰腺癌细胞株的构建

目的构建并鉴定再生基因4(regenerating islet-derived family member 4,RegⅣ)短发夹干扰RNA(short hairpin RNA,shRNA)慢病毒载体,继而建立稳定干扰RegⅣ基因表达的胰腺癌细胞株PANC-1。方法使用聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)检测RegⅣ基因在胰腺癌细胞株中的表达情况。构建重组靶向干扰RegⅣ基因的shRNA慢病毒表达质粒pGC-shRNA-RegⅣ,用脂质体转染的方法将载体导入胰腺癌细胞,建立稳定表达shRNA的细胞株。使用荧光定量PCR检测干扰效率。RegⅣ基因过表达载体的构建方法为:将获取的目的基因与pEGFP-RegⅣ-3FLAG过表达质粒载体分别进行双酶切,利用电泳回收双酶切产物,转化感受态细胞并进行测序验证,验证成功后,使用Western blot检测其在293T细胞中的表达强度。结果 PCR结果显示RegⅣ在PANC-1中表达最高,在BxPC-3中表达最低。测序验证pGC-shRNA-RegⅣ重组质粒构建成功。将重组质粒稳定转染入胰腺癌细胞株PANC-1后能明显抑制RegⅣmRNA表达水平。过表达载体pEGFP-N1-3FLAG-RegⅣ合成成功后进行Western blot鉴定,验证pEGFP-N1-3FLAG-RegⅣ过表达载体构建成功。过表达RegⅣ基因转染BxPC-3后,与空质粒组相比,RegⅣ表达量明显提高。结论成功建立了靶向稳定干扰RegⅣ基因表达的shRNA胰腺癌细胞株PANC-1。

siRNA阻断肌成纤维细胞内源性Smad3表达的研究

目的观察Smad3基因的RNA干扰(RNAi)对转化生长因子β1(TGF-β1)诱导的小鼠肌成纤维细胞(C2C12)的Smad3表达。方法实验分为实验组、内对照组和空白对照组。用不同浓度TGF-β1干预C2C12细胞,利用体外转录合成的siRNA-Smad3,以阻断Smad3基因表达。用Westernblot检测Smad3和磷酸化的Smad3。结果5ng/mlTGF-β1干预C2C12细胞,促进Smad3磷酸化。0.5h开始诱导Smad3磷酸化,5h达高峰。TGF-β1干预C2C12细胞,诱导Smad3磷酸化呈剂量依赖性。siRNA-Smad3转染C2C12细胞24h,Smad3表达逐渐被抑制到无表达。siRNA-Smad3转染C2C12细胞24h后,加5ng/mlTGF-β1干预,Smad3无表达。结论TGF-β1促进C2C12细胞Smad3磷酸化呈剂量与时间依赖性;siRNA阻断C2C12细胞Smad3表达与Smad3磷酸化。

多种siRNA的抗肿瘤作用研究

目的:研究短干扰RNA(short interfering RNA,siRNA)的抗肿瘤作用。方法:采用MTT法检测siR-NA的生长抑制作用,H&E染色法观察细胞形态变化,TUNEL标记法检测核DNA断裂,Western Blot法分析蛋白表达水平变化和流式细胞法检测细胞周期分布变化。结果:siRNA-Bcl2,siRNA-MDM2,siRNA-CDK2和siRNA-HRas可以明显抑制人乳腺癌MCF-7等肿瘤细胞的生长;siRNA-MDM2和siRNA-Bcl2可以引起MCF-7细胞染色质凝集;siRNA-Bcl2,siRNA-MDM2,siRNA-CDK2和siRNA-HRas均可以明显降低靶基因的表达水平,同时诱导MCF-7细胞发生染色体DNA断裂;siRNA-MDM2还可以导致MCF-7细胞发生G1期阻滞。结论:siRNA可以明显抑制肿瘤细胞的生长,降低靶基因的表达水平,并诱导肿瘤细胞凋亡和周期阻滞,提示siRNA可能发展成为一类高效特异的新型抗肿瘤药物。

趋化性细胞因子受体CXCR4基因沉默对大肠癌细胞体外侵袭及增殖能力的影响

目的:研究趋化性细胞因子受体CXCR4短干扰RNA(siRNA)对大肠癌细胞系体外侵袭及增殖能力的影响.方法:利用T7 RNA聚合酶体外合成以CXCR4为靶基因的siRNA,用脂质体转染大肠癌SW480细胞,同时设立空白对照组和无关对照组.于转染后48h采用RT-PCR方法检测CXCR4 mRNA水平,免疫印迹方法检测CXCR4和MT1-MMP的蛋白质水平,Boyden小室模型检测体外侵袭能力的变化,流式细胞术检测细胞周期的分布情况,MTT法测定细胞增殖状况.结果:SW480细胞转染CXCR4 siRNA 48h后,与空白对照和无关对照相比,CXCR4 mRNA水平明显下调(51.53%±6.1% vs 78.4%±3.3%.P<0.01:51.53%±6.1% vs 87.4%±5.3%,P<0.01),CXCR4的蛋白质水平明显降低(47.3%±3.7% vs 107.2%±3.6%,P<0.01;47.3%±3.7% vs 114.7%±4.8%,P<0.01),MT1-MMP蛋白表达水平也明显下降(43.8%±2.5% vs 64.4%±4.4%,P<0.01;43.8%±2.5% vs 67.0%±2.9%,P<0.01),细胞的体外侵袭能力减弱(26.5%±6.1% vs 73.7%±3.4%,P<0.01;26.5%±6.1% vs 64.5%±5.7%,P<0.01),细胞周期的分布无明显差异.在无SDF-1存在的情况下,各组细胞的增殖无明显改变;经SDF-1刺激后,各组细胞增殖增加,但CXCR4 siRNA转染组细胞的增殖显著低于空白对照组和无关对照组(24h:0.55±0.03 vs 0.68±0.06,0.71±0.04,P<0.05;48h:0.67±0.04 vs 0.89±0.03,0.94±0.07,P<0.05;72 h:0.72±0.06 vs 1.36±0.08,1.53±0.07,P<0.01).以上各指标在空白对照和无关对照之间无显著性差异(P>0.05).结论:以CXCR4为靶向的siRNA能够有效下调CXCR4基因,降低SDF-1诱导的大肠癌细胞系体外侵袭能力及增殖海性.

siRNA脱靶效应研究进展

RNA干扰过程中,siRNA和mRNA特异结合能够使得靶基因沉默。但研究证实,siRNA可能与非靶基因结合而导致非靶基因沉默,这种现象称为siRNA脱靶效应。多种真核生物中的RNA干扰实验证实了脱靶效应的存在。对脱靶机制的研究发现脱靶可能与模体匹配、结构和长dsRNA等有关,很多新方法被提出来预测脱靶概率和检测脱靶基因。通过利用siRNApool、化学修饰和生物信息学方法能够尽可能地降低脱靶效应,提高RNAi实验的质量。对脱靶效应方面的研究进行了总结论述。