HER2靶向重组截短型Bid片段融合蛋白对骨肉瘤细胞的促凋亡作用

目的:观察人上皮细胞生长因子受体2(HER2)靶向重组的活性截短型Bid(tBid)融合蛋白对骨肉瘤SOSP-9607细胞的促凋亡作用。方法:将抗HER2单链抗体基因e23sFv、与绿脓杆菌外毒素(PE)的转膜结构域基因(PEII)和tbid基因连接,构建成immuno-tbid(e23sFv-PEII-tbid)基因,将其克隆入真核表达载体pCMV中,转染SOSP-9607细胞,间接免疫荧光法检测目的蛋白表达和细胞形态学变化,通过AnnexinⅤ染色、流式细胞仪检测观察其促凋亡作用。结果:转染SOSP-9607细胞后,间接免疫荧光染色检测出tB id的表达,SOSP-9607细胞出现明显的固缩,核浓缩等凋亡特征。AnnexinⅤ染色、流式细胞仪检测可见明显的凋亡细胞,凋亡率为42%,对照组细胞仅6%,表明细胞膜表面有磷脂酰丝氨酸外翻,提示重组immuno-tbid基因表达后有促凋亡作用。结论:重组immuno-tbid基因可在转染的SOSP-9607细胞中表达,并诱导其细胞凋亡。

粘虫颗粒体病毒增效蛋白基因片段优化及功能

【目的】研究转宿主粘虫颗粒体病毒(Pseudaletia unipuncta granulovirus,Pu GV-Ps)增效蛋白基因截短片段优化及其增效作用,探索增效蛋白基因的合理利用途径。【方法】生物信息学分析增效蛋白结构域,构建增效蛋白基因截短片段原核表达载体,分析目的基因片段表达产物的表达水平、围食膜蛋白降解效能和增强活性,进一步明确Pu GV-Ps增效蛋白基因的功能区域。【结果】Pu GV-Ps增效蛋白含有M60-like结构域、锌离子催化域和糖蛋白结合域,并包含13个潜在的糖基化位点。以此为依据设计P69(短截M60-like结构域)和P77(短截糖蛋白结合域)2个截短片段,构建了表达载体p ET15b-P69和p ET15bP77,原核表达量明显高于全长基因P104。表达产物纯化蛋白围食膜降解活性表明,P69对斜纹夜蛾围食膜大分子蛋白降解程度高于P77,但两者均低于P104。病毒增强苏云金杆菌(Bt)实验表明,截短片段的表达产物提高了Bt对小菜蛾的毒力,但增强活性显著低于P104。【结论】研究结果表明,Pu GV-Ps增效蛋白基因N端M60-like结构域和C端糖蛋白结合域对其增效作用的发挥都具有一定功能,这些结构对维持增效蛋白的构象也发挥了一定的作用,截短片段P69有利于保持Pu GV-Ps增效蛋白的活性、提高表达水平。该研究结果对增效蛋白的工业化生产具有一定的指导意义。