黄色短杆菌中L-异亮氨酸同位素丰度及分布的分析方法研究

随着代谢组学、蛋白质组学等生命科学领域的迅猛发展,稳定同位素标记试剂,尤其是标记氨基酸,因无放射性、与非标记化合物理化性质一致等优势得到广泛应用。该文建立了一种稳健、快速的氨基酸同位素丰度分析方法。方法采用Hypersil Gold Vanquish(100 mm×2.1 mm,1.9µm)色谱柱,以水和含0.1%甲酸的甲醇为流动相,正离子模式下进行液相色谱-高分辨质谱联用(LC-HRMS)分析;测得细菌发酵液中L异亮氨酸-15N的同位素丰度为98.58%,相对标准偏差为0.03%,可应用于不同稳定同位素(15N或^(13)C)示踪的黄色短杆菌中L-异亮氨酸同位素丰度及分布的准确测定。该方法具有简便、灵敏、稳健等优点,有望在合成生物学、同位素示踪代谢流等研究中发挥重要作用。

耐寒短杆菌SDB5对小白菜农艺性状及营养品质的影响

为了研究耐寒短杆菌SDB5对小白菜生长及营养品质的影响,本试验以小白菜(小杂55)为材料,用SDB5菌和清水分别处理种子后,播种待植株成熟后对小白菜的农艺性状、叶绿素及营养品质进行测定,探究该菌株对小白菜以上指标的影响。试验结果表明:与对照相比,使用了SDB5菌的小白菜株高、根鲜(干)重、成叶数、叶鲜(干)重、叶柄鲜(干)重、根冠比都增加,其中株高差异显著,其余差异均不显著。产量增加9.63%,说明该菌株对小白菜有一定增产效果。小白菜的主要营养品质指标中维生素C含量显著提高、硝酸盐含量显著降低,可溶性蛋白略有提高,叶绿素,还原性糖,淀粉、纤维素含量等略有降低,但差异均不显著。说明耐寒短杆菌SDB5使小白菜的营养品质在一定程度上得到了改善。

固定化产氨短杆菌MA-2、黄色短杆菌MA-3反应动力学的研究

The kinetics of immobilized cells of \%Brevibacterium ammoniagenes MA\|2\% and \%Brevibacterium flavum MA\|3\% cells were studied. By means of both a theoretical analysis of diffusion in the gel particles and an experimental determination of apparent kinetic parameters, the intrinsic kinetic parameters of immobilized cells of \%B.ammoniagenes MA\|2\% and \%B.flavum MA\|3\% cells were obtained.

絮凝方法收集产氨短杆菌MA-2、黄色短杆菌MA-3条件的优化

采用壳聚糖作絮凝剂收集富含延胡索酸酶活力的产氨短杆菌MA 2、黄色短杆菌MA 3。研究了絮凝剂加入量及加入时混合方式与时间等因素对延胡索酸酶活力及分离效果的影响 ,并对壳聚糖絮凝收集产氨短杆菌MA 2、黄色短杆菌MA

优势短杆菌对多环芳烃的降解性能

本研究从长期被焦化废水污染的污泥中分离出一株优势短杆菌 .研究该菌株及其在无机离子存在下对蒽、菲、芘的降解性能 .结果发现该菌株对蒽、菲、芘均有良好的降解效果 ,Fe3 + 对降解过程有促进作用 ,反应 1 0h后 ,蒽、菲、芘转化率分别可达约 75 % ,87% ,及 62 % .总有机碳 (TOC)的测定结果表明 ,该菌株在 1 0 6h内能分别将反应瓶中加入的蒽、菲、芘所产生的总有机碳去除 5 0 %、90 %及 5 0 %

营养及环境条件对黄色短杆菌WL-10发酵生产L-异亮氨酸的影响

研究了能积累 L 异亮氨酸的黄色短杆菌WL 10的菌体生长规律 ,并讨论了葡萄糖、玉米浆以及磷酸盐等几个主要的营养物质对其积累L 异亮氨酸的影响 ,确定了较优的发酵条件为 :葡萄糖 12 % ,(NH4) 2 SO42 % ,玉米浆 2 % ,KH2 PO40 1% ,MgSO40 0 5 % ,CaCO33% ,种龄 9h ,接种量为 6 %。在此条件下 72h摇瓶产酸可达 2 3%左右。在上述基础上 ,研究了不同温度对WL 10积累L 异亮氨酸的影响 ,提出了分阶段变温控制的操作模式 ,即 0～2 5h ,培养温度为 31℃ ,2 5h后将温度降为 2 8℃ ,采用 5L罐实验 6 0h可积累L 异亮氨酸2 5 %。

一种新微胶囊固定化黄色短杆菌产谷氨酸研究

针对微生物发酵生产谷氨酸过程中存在的问题,提出了一种固定化微生物发酵生产谷氨酸的新方法.采用硫酸纤维素钠(NaCS)和聚二甲基二烯丙基氯化铵(PDMDAAC)构成:NaCS-PDMDAAC微胶囊,由此微胶囊固定化黄色短杆菌后发酵生产谷氨酸.考察了不同质量浓度葡萄糖对游离和微囊化黄色短杆菌产谷氨酸的影响,并利用微胶囊化的黄色短杆菌进行多批次半连续培养.结果表明,NaCS-PDMDAAC微胶囊与产谷氨酸的黄色短杆菌有很好的生物相容性,与游离培养相比较,微囊化后的黄色短杆菌的生长和产酸功能基本不受影响,容易获得较高的菌体密度,生产效率大大提高,胶囊平均生产能力可达到了15.29 g/(L·h).

大肠杆菌pheA基因在黄色短杆菌中的克隆与表达

在大肠杆菌中，影响苯丙氨酸生物合成的关键酶基因之一是ｐｈｅＡ基因。利用大肠杆菌棒状杆菌穿梭表达载体ｐＬＣＸ３６克隆了一个对反馈抑制不敏感的大肠杆菌基因ｐｈｅＡ，组建成质粒ｐＬＣＸ３７。ｐＬＣＸ３７以接合转移方法转移到抗氟代苯丙氨酸的黄色短杆菌３６２１等菌株中，获得若干基因工程菌株。经发酵测定，编号为３６２１０９的黄色短杆菌的苯丙氨酸产量比出发菌３６２１高出１倍。最高达２６２６ｍｇ／ｍｌ。

NH_4^+浓度对黄色短杆菌XV0505发酵生产L-缬氨酸的影响

以L-缬氨酸(L-Val)生产菌黄色短杆菌XV0505为供试菌株,以(NH4)2SO4为唯一添加N源,考察不同NH 4+浓度对发酵过程中菌体干质量、L-Val产量和葡萄糖消耗速率以及菌体内代谢流量的影响。研究表明:NH 4+浓度过高或不足都会影响发酵水平,降低L-Val的产量。合适的初始NH4+浓度为225 mmol/L,产酸期NH4+维持浓度为35 mmol/L时,有利菌体产酸。在此NH4+浓度下,在30 L发酵罐发酵60 h,发酵液中菌体生物量和L-Val质量浓度分别可达22.35和59.12 g/L。

三相分离甾短杆菌胆固醇氧化酶及其性质

三相分离（TPP）是将硫酸铵与叔丁醇混合后形成有机相、中间沉淀相和水相。在20°C,调节发酵上清液的pH至6.0,加入硫酸铵使终浓度为400 g/L,溶解后加入与上清液等体积的叔丁醇,静置1 h分相,胆固醇氧化酶在有机相和水相之间形成蛋白沉淀,12 000 r/min离心10 min收集中间蛋白相,用pH 7.5,10 mmol/L的磷酸缓冲液溶解。结果表明：利用三相分离技术从乳化体系中分离纯化胆固醇氧化酶,比酶活提高了3.49倍,收率达93%。回收的酶液进一步经过DEAE-Sepharose Fast Flow纯化,比酶活从3.56 U/mg提高到30.15 U/mg。该酶最适反应温度为60°C,最适反应pH为7.5,酶的等电点为8.5,该酶在37°C,pH 6.0~8.0较为稳定。Hg2＋和Ag＋离子完全抑制胆固醇氧化酶的活性。

一株黄色短杆菌基因工程菌株的构建及其L-缬氨酸积累

从谷氨酸棒杆菌模式菌株C.glutamicumATCC13032中克隆出L-缬氨酸合成途径上的限速酶——乙酰羟酸合酶编码基因ilvBN。对ilvBN进行定点突变,获得其抗反馈抑制突变型ilvBNr。以大肠杆菌-黄色短杆菌穿梭表达载体pDXW-10为基础,构建重组质粒pDXW-10-ilvBNr,并转化野生型黄色短杆菌B.flavumATCC14067,获得工程菌株ATCC14067/pDXW-10-ilvBNr。3L罐发酵实验结果显示:在野生型菌株发酵液中检测不到L-缬氨酸积累,而工程菌株发酵液中L-缬氨酸积累达5.0g/L。

原生质体融合选育肌苷产生菌产氨短杆菌GMA-2802

以肌苷产生菌产氨短杆菌ＧＭＡ－２７２２（Ａｄｅ－、 Ｇｕａ－、ＶＢ１－、Ｒｉｆｒ）和 ＧＭＡ－２７７６（Ａｄｅ－、 Ｂｉｏｔｉｎ－、ＶＢ１－、Ｓｍｒ）为出发菌株，经原生质体融合，将目的标志加以组合，获得遗传性状稳定、摇瓶发酵６１ｈ，产肌苷２５．４ｇ／Ｌ的融合子 ＧＭＡ－２８０２（Ａｄｅ－、Ｇｕａ－、Ｂｉｏｔｉｎ－、ＶＢ１－、 Ｒｉｆｒ、Ｓｍｒ）。

黄色短杆菌变异株AN78的发酵生产L-精氨酸的研究

以黄色短杆菌(Brevibacterium flavum)AG77(AHV^r,TA^r,SG^r)为诱变出发菌株,经亚硝基胍(NTG)诱变处理和选育,获得一株能够积累大量L-精氨酸的菌株AN78(AHV^r,TA^r,SG^r,His^-)。AN78菌株在20L发酵罐中,以葡萄糖为碳源,以玉米浆、硫酸铵等为氮源的培养基中培养4d,产酸率可达61.1g/L,对糖转化率20.2％,与AG77菌株相比较,分别提高了95％和39.3％。发酵液中L-精氨酸的提取收率为71％。

黄色短杆菌氟基丙酮酸敏感型突变株的诱变选育

以黄色短杆菌 (Br.FlavumC - 12 )为出发菌株 ,亚硝基胍 (NTG)为诱变剂 ,通过诱变选育 ,筛选出氟基丙酮酸 (FP)敏感的菌株 ,以希望达到降低L

乳糖发酵短杆菌lysC突变对L-赖氨酸积累的影响

从一株乳糖发酵短杆菌L-异亮氨酸生产菌中克隆出天冬氨酸激酶AK-1的编码基因ly-sC1,经DNA测序并与来自谷氨酸棒杆菌ATCC13032的野生型lysC比对发现其中有2个核苷酸1186G和1187C缺失,造成翻译提前终止。AK-1还有下列2个有效突变位点:Ala 279 Thr和Ser317 Ala。lysC1在大肠杆菌BL21中的诱导表达量约为lysC的1/4,其表观比酶活也较低,但对L-苏氨酸和L-赖氨酸协同反馈抑制不敏感。用大肠杆菌-黄色短杆菌穿梭表达载体pDXW-8将ly-sC1在野生型乳糖发酵短杆菌ATCC13869中诱导型表达,经摇瓶发酵积累L-赖氨酸7.4 g/L,在3 L发酵罐上达40 g/L。

黄色短杆菌TK0303的L-亮氨酸生物合成途径分析

应用途径分析方法分析了在拟稳态时黄色短杆菌(Brevibacterium flavum)TK0303由葡萄糖发酵生产L-亮氨酸的代谢途径,确定了L-亮氨酸合成的最佳途径和最大理论产率。通过比较途径分析所获得的反应模型,确定了丙酮酸和乙酰辅酶A是L-亮氨酸合成途径的关键节点。在此基础上改变外界环境因子,强化L-亮氨酸生物合成途径中丙酮酸和乙酰辅酶A两个关键节点的代谢流,以期进一步提高L-亮氨酸产率。结果表明,经过谷氨酸以及醋酸铵的调节,代谢途径流量发生显著变化,L-亮氨酸产量有明显提高。

葡萄糖流加方式对黄色短杆菌生产L-亮氨酸的影响

利用30 L发酵罐,研究了黄色短杆菌TK0303生产L-亮氨酸的发酵工艺。考察了初始葡萄糖浓度和发酵过程中3种补料策略(分批间歇流加补料、恒葡萄糖浓度流加补料和DO-在线识别流加补料)对菌体生物量、L-亮氨酸产量、副产物含量及糖酸转化率的影响。最终确定:分批补料发酵的初始葡萄糖浓度为60 g/L,葡萄糖补加采用DO-在线识别流加方式。根据溶氧响应信号的特征反馈控制葡萄糖的流加速率,可实现葡萄糖的限制培养,有效减少了发酵副产物的含量,菌体生物量和L-亮氨酸产量得到显著提高,分别为21.8 g/L和41.3 g/L,且糖酸转化率高达22.4%。

产氨短杆菌生长曲线的测定

为了解产氨短杆菌的繁殖规律,试验采用分光光度法测定产氨短杆菌的不同生长时间培养液适宜比例稀释液的OD600 nm值,以培养时间为横坐标,OD600 nm值为纵坐标作产氨短杆菌生长曲线图,同时再利用平板菌落计数法绘制生长曲线进一步验证。结果表明:产氨短杆菌在适宜生长条件下经历延滞期、对数期、稳定期和衰亡期4个时期,符合细菌生长的规律,为人们根据不同需要有效地利用和控制产氨短杆菌的生长提供参考。

响应面分析应用于短杆菌产酶工艺的优化

本文研究了用响应面分析法(RSM)优化短杆菌产胆固醇氧化酶的工艺,发现胆固醇添加量及超声处理时间是影响短杆菌产酶最重要的因素。在模拟优化的条件下:胆固醇为4.076g／L,吐温-80为0.2932％(v／v),照射时间为22.361min,COD最大产量1.483U／mL。

短杆菌属产胆固醇氧化酶的发酵条件优化

短杆菌属(Brevibacterium sp.)是胆固醇氧化酶高产菌,对其进行底物诱导及发酵条件的优化,其最适培养基为蔗糖0.3%,酵母膏0.2%,蛋白胨0.3%,牛肉膏0.3%,K2HPO4 0.1%,MgSO4 0.05%,pH6.8。最适培养条件为接种量5%,24℃培养20h,通气量为50mL培养基/250mL三角瓶,200r/min。结果表明,胆固醇氧化酶的酶活力可达到2439U/L,比未优化前195U/L提高了12倍。在pH6.5和温度54℃条件下测得酶米氏常数Km值为7.1×10-5 mol/L。