短梗霉素A对灰葡萄孢菌生长的影响

通过考察短梗霉素A(AbA)对灰葡萄孢菌野生株BcAUR1及其AUR1基因内含子缺失突变株BcAUR1a生长的影响,明确AbA抑制真菌生长的机理。AbA敏感性试验表明,低浓度AbA(8μg/mL)显著抑制野生株BcAUR1菌体的生长,高浓度AbA(50μg/mL)存在下观察不到BcAUR1的生长迹象。突变株BcAUR1a则不受AbA的影响,在低浓度和高浓度AbA存在下均能正常生长。AbA抑制BcAUR1侵染柑橘果实,但BcAUR1a在高浓度AbA存在下也能够有效感染柑橘果实。这两个试验均证实了突变株BcAUR1a具有AbA抗性。电镜观察表明,AbA引起BcAUR1细胞质膜和内膜系统形态异常,质膜和液泡膜断裂,细胞内物质泄露。AbA抑制灰葡萄孢菌生长的机制是由于IPC合成酶受到抑制,导致鞘磷脂类物质合成不足,细胞膜结构破坏,胞内物质外漏。

灰葡萄孢菌AUR1基因对细胞生长和繁殖的影响

[目的]明确灰葡萄孢菌AUR1基因(Bc AUR1)对灰葡萄孢菌细胞生长、发育和繁殖的作用。[方法]采用PCR扩增Bc AUR1的P和T片段,依次克隆于p TFCM质粒载体的潮霉素基因两侧,构建灰葡萄孢菌AUR1断裂基因表达载体,通过农杆菌介导转化灰葡萄孢菌,在潮霉素抗性培养基上筛选转化子。Ab A处理灰葡萄孢菌,观察细胞形态。[结果]断裂基因转化子比空载转化子显著减少,说明Bc AUR1断裂基因同源重组替代了宿主AUR1基因,导致转化子不能存活。Ab A显著影响野生型灰葡萄孢菌的生长发育,导致孢子萌发延迟、菌丝形态异常,不能形成分生孢子头;但Ab A不影响抗Ab A突变体Bc AUR1a的生长发育。[结论]AUR1基因对灰葡萄孢菌生长、发育和繁殖起重要作用。

灰葡萄孢菌AUR1基因真核表达载体的构建、表达及酶活性分析

为了研究灰葡萄孢菌肌糖磷脂酰神经酰胺合成酶(BcAUR1基因)的表达及酶活性,采用RT-PCR方法,利用含有FLAG标签以及BamHⅠ、XhoⅠ酶切位点的AUR1特异引物从灰葡萄孢菌中扩增得到BcAUR1基因。将BcAUR1基因与穿梭质粒pYES2重组,得到pYES2-BcAUR1质粒采用醋酸锂转化法导入酿酒酵母尿嘧啶突变菌株Δyor1中,Western blotting检测肌糖磷脂酰神经酰胺(IPC)合成酶表达,HPLC检测IPC合成酶活力。结果显示pYES2-BcAUR1在酿酒酵母尿嘧啶突变菌株Δyor1中获得表达,pYES2-BcAUR1转化子IPC合成酶活性显著增高,比空载转化子约提高1倍。低浓度的AbA能够抑制空载pYES2酵母转化子生长,但pYES2-BcAUR1酵母转化子能抵抗AbA对菌体生长的抑制。