产酶新菌株涅氏短状杆菌的分离及其鉴定

从土壤中分离纯化得到的菌株，经中国典型培养物保藏中心鉴定，属于国内尚未发现的Brachybacterium nesterenkovii种类的产酶新菌株。其形态为短杆状，大小为（0．5～0．75）μm×（1．0～2．5）μm，且不产内生孢子也无运动性。通过生理生化特性鉴定可知：Brachybacterium nesterenkovii菌株可以利用L-乳酸、乙酸、丙酮酸、α-酮基-戊二酸、D-半乳糖、龙胆二糖、α-D-葡萄糖、D-木糖等多种物质作为碳源，也可以利用L-丙氨酸、L-谷氨酸、L-天冬酰胺和丁二胺作为氮源。此外Brachybacterium nesterenkovii菌株可以产过氧化氢酶、酯化酶、乙醇脱氢酶和乙醛脱氢酶等多种酶。研究了菌株的培养条件及其功能。

短状杆菌的DNA分子杂交与分类学研究

利用非放射性光敏生物素标记ＤＮＡ分子与固定在微稀释板上的热变性单链ＤＮＡ杂交的方法，对短状杆菌（Ｂｒａｃｈｙｂａｃｔｅｒｉｕｍ）１５个菌株的染色体ＤＮＡ进行分子杂交．通过测定荧光强度，确定ＤＮＡ间的同源值．根据其遗传相关性，对难以从形态特征、生理生化特性等进一步分类的细菌在种的水平上定论，确定其应有的分类位置．光敏生物素标记ＤＮＡ，在微稀释板上进行分子杂交是一种准确、快速的杂交技术，在短状杆菌的分类学研究中起着决定性的作用．

细胞脂质分析和DNA分子杂交在短状杆菌分类学研究中的作用

利用薄层层析和气相色谱测定１２株细菌的脂肪酸组份，通过ＵＰＧＭＡ聚类分析绘制其树状图谱；用双相薄层层析获得特征性的极性酯图谱；经光敏生物素非放射性标记ＤＮＡ进行分子杂交测定实验菌株间的ＤＮＡ同源值．一致的结果表明，１２株菌株应分别划归短状杆菌属的３个种，其中有２个被命名为新种，即ＢｒａｃｈｙｂａｃｔｅｒｉｕｍｃｏｎｇｌｏｍｅｒａｔｕｍＩＦＯ１５４７２Ｔ和Ｂ．ｐａｒａｃｏｎｇｌｏｍｅｒａｔｕｍＩＦＯ１５２２４Ｔ．应用上述方法，能有效地对难以从形态特征。

430不锈钢厚规格冷板表面短擦状白印缺陷分析与控制

430不锈钢厚规格冷板在冷轧生产过程中表面出现了严重的短擦状白印缺陷,通过大量的现场试验研究,分析了短擦状白印缺陷产生的原因,结合现场设备生产工况,规范穿带操作方式、优化换辊制度以及轧制工艺,可以有效控制430不锈钢厚规格冷板表面短擦状白印缺陷的产生。

bcl-x_L短发夹状RNA诱导人鼻咽癌细胞株CNE-2Z凋亡(英文)

背景与目的:实验证明bcl-xL 在鼻咽癌细胞株CNE-2Z 中存在高表达,它可能在鼻咽癌的发生发展、转移及治疗过程中产生耐药等方面发挥重要作用。本研究拟探讨bcl-xL 短发夹状RNA (shorthairpin RNA ,shRNA )诱导CNE-2Z 细胞凋亡的作用。方法:把表达bcl-xL shRNA 的重组质粒pm U6-RNAi转染到CNE-2Z细胞中,用荧光染色和流式细胞术等方法检测细胞凋亡;用逆转录聚合酶链反应(reverse transcription-polym erase chain reaction,RT-PCR )检测bcl-xL、bcl-2、survivin和caspase-3的m RNA 表达水平;用W estern blot检测Bcl-xL、Caspase-3和P53的蛋白表达水平。结果:流式细胞术检测发现,pm U6-RNAi重组质粒作用24h 后,细胞出现明显的凋亡峰;H oechst33258单染在荧光显微镜下可见细胞缩小、染色质固缩和核断裂;RT-PCR 分析pm U6-RNAi重组质粒作用细胞后明显下调了bcl-xL、bcl-2和caspase-3的m RNA 表达水平, 对survivin 的m RNA 表达水平无影响;W estern blot分析pm U6-RNAi质粒作用细胞后明显下调了Bcl-xL、Caspase-3的蛋白表达水平,而大幅度上调了P53的蛋白表达水平。结论:bcl-xL shRNA 可诱导CNE-2Z 细胞凋亡;CNE-2Z 细胞的凋亡可能与bcl-2、caspase-3和p53有着密切的关系;质粒表达的bcl-xL shRNA

survivin短发夹状RNA真核表达载体的构建及其对宫颈癌细胞survivin表达的影响

目的:构建survivin基因短发夹状RNA(shRNA)真核表达载体,并观察其对宫颈癌细胞survivin表达的抑制作用。方法:设计、合成2对survivin特异性微小片段RNA引物(s1、s2),退火连接后利用DNA重组技术,将其分别克隆入真核表达载体pSilencer 2.1-U6 neo,酶切、鉴定测序后,经脂质体转染宫颈癌HeLa细胞,G418筛选阳性克隆,半定量RT-PCR检测survivin mRNA表达,Western blot检测survivin蛋白表达。结果:成功构建了survivin shRNA真核表达载体pSilencer2.1-s1和pSilencer2.1-s2,G418筛选24 d后出现阳性克隆,转染pSilencer2.1-s1和pSilencer2.1-s2的HeLa细胞中,survivin表达呈现不同程度下调,pSilencer2.1-s2的干涉效果较好。结论:成功构建并筛选出干涉效果较好的survivin shRNA真核表达载体,为进一步研究其对宫颈癌细胞生物学行为的影响奠定了实验基础。

核干细胞因子特异性短发夹状RNA对HL-60细胞分化抗原和生物学性质的影响

目的研究核干细胞因子(nuc leostem in,NS)特异性短发夹状RNA(shRNA)阻断NS基因表达对HL-60白血病细胞分化抗原及生物学性质的影响,探讨NS的生物学功能和与急性白血病的关系以及用于基因治疗的可能性。方法特异性转染试剂和合成的NS短发夹状RNA(NS-shRNA)体外直接转染HL-60细胞,采用RT-PCR判断基因阻断效果,MTT法测定转染后细胞增殖能力,流式细胞仪(FCM)测定细胞分化抗原,形态学观察细胞形状和生长状态,血细胞分析仪测定细胞大小、粒度。结果合成的2条NS-shRNA均能明显阻断NS基因表达,抑制率分别为37.82%和71.88%;NS-shRNA能显著抑制HL-60细胞的增殖并存在时间和浓度依赖性,以48 h和10 nmol/L浓度最佳。转染后:分化抗原CD11b、CD33、CD14、CD64、HLA-DR增高,CD38降低,显示有向粒系继续成熟和向单核系重新分化趋势;细胞聚团性减弱,碎片增多,一部分细胞形态变成梭形和长尾形,染色后细胞核紧密,凹陷,髓过氧化物酶(MPO)和α-醋酸萘酚酯酶(α-NAE)活性增强;大小和粒度分析小体积细胞和核碎裂细胞增多。结论NS-shRNA通过阻断NS基因表达,对HL-60细胞有抑制增殖和促分化作用,改变了细胞的生物学性质,使细胞恶性程度有所减弱,并有可能诱发凋亡,在白血病的基因中具有潜在的临床价值。

三位点短发卡状RNA在提高RNA干扰效率中的作用

背景与目的:shRNA技术是近来发展的热点技术之一,但普遍采用的单位点shRNA干扰载体效果并不理想。本研究探讨三位点短发卡状RNA在提高RNA干扰效率中的作用。方法:构建外源基因DsRed全长载体转染HEK293细胞。针对报告基因DsRed设计4个干扰载体,一个含有3段shRNA,另外3个分别含有此3段中1段shRNA。转染293/DsRed,荧光显微镜观察基因DsRed。应用实时定量PCR(Real-timePCR)和流式细胞仪(FACS)检测4个载体对DsRed基因在mRNA及蛋白水平干扰效应。结果:4个载体对靶基因DsRed在mRNA及蛋白水平均有干扰效应,且含有3段shRNA载体对DsRed基因干扰效率为(89±16)%,显著高于3个只含有1段shRNA载体[(50±23)%,(52±15)%,(55±27)%],差异有显著性(P<0.05)。结论:三位点shRNA干扰载体可以提高对靶基因的干扰效率。

Nucleostemin基因特异性短发夹状干扰RNA在裸鼠移植瘤模型体内的抗白血病作用

目的探讨核干细胞因子(NS)特异性短发夹状干扰RNA(NS-shRNA)在裸鼠移植瘤模型体内的抗白血病作用。方法对数生长期HL-60细胞接种于裸鼠皮下使其致瘤并洗脱,体外传至第5代再次接种裸鼠,Transwell法验证HL-60细胞体外侵袭力,建立高致瘤性HL-60白血病细胞异种移植瘤裸鼠模型。腹腔注射体外合成的NS-shRNA脂质包裹体,观察治疗前后瘤体体积、重量的变化,组织切片、HE染色观察肿瘤细胞学改变,免疫组织化学检测瘤体细胞内NS蛋白含量,TdT介导的dUTP缺口末端标记技术(Tunel)检测细胞凋亡情况。结果制备的高致瘤性HL-60细胞使30只裸鼠均形成异种移植瘤,成瘤率为100%,瘤体大小均一。腹腔注射NS-shRNA脂质包裹体13天后,治疗组裸鼠移植瘤体积增长率为207.1%,阴性和空白对照组分别为497.1%和569.6%。治疗组瘤体重量为(1.18±0.27)g,阴性和空白对照组为(2.04±0.73)g和(2.35±0.41)g。切片观察治疗组有大量斑片状组织结构破坏,并出现"凋亡特征"样细胞改变。免疫组织化学检测治疗组移植瘤细胞NS蛋白阳性率和积分值分别为(71.59±1.80)%和(110.26±13.46),阴性对照组为(90.72±1.47)%和(195.11±9.71),空白对照组为(97.33±1.76)%和(220.93±16.54),与阴性和空白对照组相比,NS蛋白表达抑制率分别为43.5%和50.1%。Tunel法检测治疗组移植瘤内出现较多凋亡细胞。结论 NS-shRNA在裸鼠移植瘤模型体内具有抗白血病作用,其作用机制之一可能是通过下调NS表达诱发白血病细胞凋亡增加。

T7启动子介导体外构建Nucleostem in特异性短发夹状干扰RNA

目的体外构建合成针对Nuc leostem in(核干细胞因子,NS)基因的短发夹状干扰RNA(shRNA),用于进一步研究以该基因为靶目标、RNA干扰(RNA interference,RNA i)为手段的白血病基因治疗可行性。方法从Nuc leostem in基因的三个变异体cDNA共同序列中筛选出2个3′端为AA的21个碱基片段作为shRNA合成的对应序列,9个碱基的5′-UCUCUUGAA-3′作为Loop环。以23个碱基的5-′GGATC-CTAATACGACTCACTATA-3′作为T7启动子(T7 Promoter)序列,构建shRNA的体外合成双链DNA模板,一条链5′端无AA,顺序为启动子、shRNA正义信息链、Loop环、shRNA反义信息链,共70个碱基;另一条是该链的互补链,5′端带有AA,共72个碱基。在T7 RNA聚合酶(T7 RNA polym erase)作用下合成shRNA,纯化后通过凝胶电泳比较灰度值确定shRNA浓度;shRNA作用于HL-60细胞,通过观察细胞形态变化和NS-mRNA抑制率验证干扰效果。结果体外合成的两条shRNA电泳无降解和弥散现象,浓度分别为5.24μmol.L-1和3.35μmol.L-1;干扰HL-60细胞48 h后,细胞密度和聚集程度下降,细胞之间大小相差悬殊,经shRNA-NS-2作用的HL-60细胞一部分由圆形变成了梭形并有明显的伪足;与对照组相比NS-mRNA抑制率分别达到37.82%和71.88%。结论体外成功构建和合成了两条针对Nu-c leostem in基因的shRNA,且抑制该基因表达的作用明显,shRNA-NS-2使HL-60细胞形态发生了改变。所合成的shR-NA-NS-2可作为进一步研究该基因和探索白血病的基因治疗的工具。

慢病毒介导短发夹状RNA沉默生存素基因对人异位内膜细胞增殖和凋亡的影响

目的:研究慢病毒介导生存素(survivin)基因特异性短发夹状RNA(shR-NA)对人异位内膜细胞中survivin基因表达及细胞增殖和凋亡的影响。方法:构建靶向survivin基因的shRNA慢病毒表达载体,将重组慢病毒感染原代培养的异位内膜细胞,以未转染及空载慢病毒感染异位内膜细胞为对照。采用RT-PCR、Western blot法分别检测各组异位内膜细胞中survivin mRNA和蛋白表达的变化,用四甲基偶氮唑蓝法检测细胞的增殖,Cy5-Annexin V/PI双染标记流式细胞仪测定细胞凋亡。结果:与未转染细胞及空载慢病毒转染细胞相比,shRNA慢病毒感染人异位内膜细胞后survivin mRNA及蛋白表达水平明显下降,survivin mRNA及蛋白表达抑制率分别为64%和59%。转染后1～5天实验组细胞生长速度较阴性对照组及空白对照组明显减慢,除第1天外,差异均有统计学意义(P<0.01);阴性对照组及空白对照组细胞生长速度的差异无统计学意义(P>0.05)。流式细胞仪分析显示,实验组细胞凋亡率为(41.61±3.64)%,明显高于阴性对照组的(9.14±1.88)%和空白对照组的(7.07±1.16)%(P<0.01),后两组的差异无统计学意义(P>0.05)。结论:慢病毒介导survivin基因特异性shRNA可有效沉默异位内膜细胞中survivin基因表达,明显抑制异位内膜细胞的增殖并促进细胞凋亡。

短发夹状RNA在人细胞诱导RNA干扰(英文)

背景与目的:RNA干扰是一种通过细胞内导入双链RNA而导致特异基因表达抑制的进化保守的转录后基因沉默现象,目前RNA干扰已成为研究基因功能的重要方法。本研究旨在利用DNA载体在细胞内产生短发夹状RNA(shorthairpinRNAs,shRNA),通过这些shRNA来诱导RNA干扰(RNAinterference,RNAi),为基因功能分析提供新的实验手段。方法:利用双荧光素酶报告系统来检测DNA载体在细胞内产生的shRNA诱导RNAi的效果。比较该载体产生的shRNA在不同条件下的RNA干扰效果。结果:DNA载体产生的shRNA在人细胞能诱导RNAi,序列特异地抑制基因表达。抑制效果与所选基因靶位点高度相关。结论:shRNA在人细胞能诱导RNA干扰,序列特异地抑制基因表达,这一方法可用于基因功能分析。

短发夹状RNA抑制GCS基因在人乳腺癌细胞的表达及逆转其多药耐药

目的构建葡萄糖神经酰胺合成酶(GCS)基因的短发夹状RNA(shRNA),观察其对人耐药乳腺癌细胞GCS表达的抑制及多药耐药的逆转作用。方法设计2对GCS基因编码的反向重复序列,中间间隔6个nt,体外合成并克隆至载体pSUPER。转染乳腺癌细胞,Westernblot和免疫细胞化学方法测定GCS表达。Westernblot、比色法检测细胞内caspase-3的表达,流式细胞仪分析细胞凋亡率。四氮唑盐(MTT)法检测半数细胞抑制浓度。结果酶切和DNA测序证实重组质粒构建成功。转染后GCS蛋白含量分别下降80%和82%,GCS表达阳性率降低为18·1%和16·7%。caspase-3表达和活性均显著增强,细胞凋亡率明显增加,细胞对化疗药物耐药性有明显下降。结论shRNA可有效抑制人耐药乳腺癌细胞中GCS表达,并可提高其对多种化疗药物的敏感性。

负载双片段survivin短发夹状RNA质粒载体的构建与鉴定

目的:设计构建负载双片段survivin短发夹状RNA(shRNA)的质粒载体,为进行前列腺癌(PCa)基因治疗的研究奠定基础。方法:分别设计2条靶向survivin基因的shRNA,克隆至质粒载体中,再分别提取质粒酶切后回收、连接,构建重组质粒,提取重组质粒酶切鉴定、测序分析。结果:负载不同单片段survivinshRNA的质粒载体分别用EcoRⅠ及SacⅠ酶切鉴定,证实设计的2条单片段survivinshRNA已经分别插入目的质粒中;基因重组后,重组质粒载体用BamHⅠ酶切鉴定,证实双片段survivinshRNA均已插入重组质粒载体中;测序结果证实重组质粒载体插入的双片段survivinshRNA序列均正确无误。结论:负载双片段survivinshRNA的RNA干扰重组质粒载体构建成功。

短发夹状RNA特异性抑制HeLa细胞的Hax-1基因表达

目的:构建靶向Hax-1基因的短发夹状干扰RNA(short hairpin RNA,shRNA)表达载体pGenesil-Hax-1,并探讨siRNA靶向抑制Hax-1基因表达的作用。方法:根据shRNA设计的原则,在Hax-1全长序列中选取含19个核苷酸靶序列,设计形成siRNA的DNA模板并克隆到shRNA表达载体pGenesil-1中,获得可靶向抑制Hax-1基因的重组shRNA表达载体。采用LipofectamineTM2000转染试剂将pGenesil-Hax-1导入HeLa细胞中;分别采用RT-PCR以及Western blot从mRNA和蛋白水平上检测干扰效果。结果:半定量PCR及Western blot结果表明,siRNA可使Hax-1mRNA的转录水平得到显著抑制(P<0.01),Hax-1蛋白的表达较对照组减少约70%。结论:靶向Hax-1基因的重组shRNA表达载体pGene-sil-Hax-1介导的siRNA可显著抑制Hax-1基因在人宫颈癌HeLa细胞中的表达。

短发夹状RNA抑制缺氧诱导因子1α在前列腺癌细胞中的表达

目的:构建产生缺氧诱导因子1α(HIF-1α)特异性短发夹状RNA(shRNA)的载体并检测其抑制作用,探讨该技术在前列腺癌治疗中的应用前景。方法:设计、合成针对HIF-1α的特异性shRNA模板序列,将其插入含有U6启动子的psilencerTM2.1-U6载体中,得到shRNA表达载体psilencer-HIF,在脂质体介导下转染前列腺癌细胞株PC-3M,应用绿色荧光蛋白质粒pEGFP共转染评价转染效率,RT-PCR及Western印迹检测其对HIF-1α表达的影响。结果:重组质粒psilencer-HIF经测序分析证实与设计的完全一致,共转染24 h后质粒转染效率为(89.26±4.72)%,其产生的shRNA在PC-3M细胞中能诱导RNA干扰(RNAi),转染后48 h HIF-1αmRNA和蛋白水平分别下降82.09%和81.61%(P<0.01);而阴性对照组HIF-1α表达水平无明显改变(P>0.05)。结论:成功构建了HIF-1α基因shRNA表达质粒,其可有效抑制前列腺癌细胞中的HIF-1α的表达,为前列腺癌的基因治疗提供了新思路。

hTERT短发夹状RNA抑制前列腺癌细胞生长的研究

目的研究靶向端粒酶逆转录酶(hTERT)的短发夹状RNA(shRNA)基因转染对前列腺癌细胞体外生长的抑制效应及其促细胞凋亡作用。方法在脂质体介导下将针对hTERT基因的shRNA表达载体psilencer-TRT转染前列腺癌细胞PC-3m,得到稳定细胞株PC-3m/shRNA-TRT。采用RT-PCR检测hTERT基因表达情况,western blot分析各组细胞hTERT及c-myc蛋白表达变化,细胞计数并绘制细胞生长曲线,Hoechst33258染色、透射电镜、流式细胞仪检测细胞凋亡情况。结果重组质粒psi-lencer-TRT转录生成的shRNA使实验组细胞的hTERT基因表达显著下调,抑制率约为89.02%;同时实验组细胞hTERT及c-myc蛋白水平较对照组有明显下降,细胞的生长增殖能力也显著降低(P<0.05),生长速率明显变慢,部分细胞呈现凋亡形态学改变,凋亡率为(19.69±4.75)%。结论hTERT短发夹状RNA能有效抑制前列腺癌细胞中hTERT表达及癌细胞生长,诱导PC-3m细胞凋亡,可望为前列腺癌的基因治疗提供新方法。

Survivin短发夹状RNA对结肠癌SW480细胞增殖和细胞周期的影响

[目的]构建survivin基因的短发夹状RNA(shRNA)表达质粒,检测它对结肠癌细胞增殖的影响。[方法]选用载体介导的RNAi技术,Westernblot检测SW480细胞转染后survivin水平的变化,流式细胞仪及MTT法检测细胞周期和细胞增殖的变化。[结果]Survivin短发夹状RNA可下调SW480细胞中survivin的表达,抑制率为60.68%,细胞周期分析显示将该细胞阻断在G2/M期,细胞增殖抑制。[结论]靶向survivin的shRNA可以降低survivin蛋白的表达,抑制结肠癌细胞的增殖。

短发夹状RNA对PC-3M细胞端粒酶逆转录酶基因表达和端粒酶活性的影响

目的:研究短发夹状RNA(shRNA)对PC 3M细胞中端粒酶逆转录酶(hTRT)基因表达及端粒酶活 性的影响。方法:构建针对hTRT基因的shRNA表达质粒psilencer TRT,在质脂体介导下转染人前列腺癌PC 3M细胞,应用RT PCR及免疫组织化学检测hTRTmRNA及蛋白表达水平,应用SYBR Green染色法检测端粒 酶活性的变化。结果:重组体psilencer TRT转染细胞24h和48h后显著下调hTRTmRNA及蛋白水平,作用 48h后,其抑制率分别为85.39%和79.17%,较空白对照组差异有统计学意义(P<0.01)。同时,随着时间的延 长,端粒酶活性亦有明显下降(P<0.01)。结论:利用短发夹状RNA干扰技术能有效抑制靶基因的表达,为前 列腺癌的基因治疗提供新思路。