冷冻干燥保护剂和再水化剂对短短小芽孢杆菌TW的存活率与贮藏稳定性的影响

利用冷冻干燥方法，阐明了冷冻干燥保护剂和再水化剂对生防短短小芽孢杆菌菌株TW（Brevibacillus brevis strain TW）的存活率和贮藏稳定性的影响。研究结果表明，使TW菌株冷冻干燥后存活率最大（达80％）的保护剂是二糖类物质。当以1％海藻糖作冷冻干燥保护剂时，使TW菌株复苏率最高（〉80％）的再水化剂是0．05mol／L磷酸缓冲液和1％蛋白胨；当以1％蔗糖作保护剂时，使TW菌株复苏率最高（〉80％）的再水化剂是磷酸缓冲液（0．05mol／L）、蛋白胨（10％、5％、1％）、蔗糖（5％、1％）和脱脂奶粉（5％、10％）。贮藏试验结果表明，当添加1％蔗糖作为保护剂的冷冻干燥菌粉，分别在起伏常温（6～33℃）和恒定低温（4℃）下贮藏18个月后，用0．05mol／L磷酸缓冲液作再水化剂，TW存活率分别可达70％和90％以上。该方法通过改进后可应用于工业化生产。

农药助剂对短短小芽孢杆菌TW-2菌体及芽孢的影响

采用平皿计数法和抑菌圈法研究了24种农药助剂对稻瘟病生防菌短短小芽孢杆菌TW-2菌株菌体和芽孢存活的影响。结果表明,供试的24种农药助剂中有11种农药助剂(D425、D450、D500、EFW、500、505、507、AEO-5、AEO-9、NP-10、OP-10)在供试浓度范围内(12.5～100 g.L-1)可以完全杀灭短短小芽孢杆菌TW-2菌株的菌体和芽孢,其它助剂随着浓度的提高,对菌体和芽孢存活的抑制作用也越大。在24种农药助剂中,U-3A和By-110对菌体和芽孢的存活影响最小,可用于短短小芽孢杆菌TW-2菌株固体制剂和液体制剂加工中的湿润展布剂。

短短小芽孢杆菌-大肠杆菌穿梭分泌表达载体的构建

应用PCR技术从具有分泌蛋白能力强且没有胞外蛋白酶活性的短短小芽孢杆菌 5 0中分离出细胞壁蛋白基因的多启动子和信号肽编码序列 ,利用它与质粒pUB110和pKF3一起构建成穿梭分泌表达载体pBKE5 0。将α 淀粉酶基因引入该载体转化短短小芽孢杆菌 5 0后 ,发现α 淀粉酶可以活性形式分泌表达。此工作为下一步建立短短小芽孢杆菌高效分泌表达系统奠定了基础。

利用短短小芽孢杆菌启动子和信号肽编码序列构建穿梭分泌表达载体

以短短小芽孢杆菌B15的总DNA为模板,利用PCR技术克隆到其细胞壁蛋白基因串联启动子和信号肽编码序列,测序分析后提交GenBank,登录号为AY956423。重新设计引物扩增该片段并在PCR产物两侧引入BamHⅠ和PstⅠ酶切位点,将PCR产物双酶切后克隆至穿梭载体pP43NMK的相应位点构建分泌表达载体pP15MK,插入片段置于该载体中mpd基因的上游,并使信号肽编码序列与去除了自身信号肽编码序列的mpd基因阅读框恰好融合。将pP15MK导入枯草杆菌构建表达菌株1A751(pP15MK),在短短小芽孢杆菌启动子和信号肽元件的带动下,mpd基因能够在表达菌株的对数生长期和稳定期持续性高效分泌表达,表达产物结合在细胞膜上;发酵液在48h酶活达到最高值7.79U/mL,是出发菌株邻单胞菌M6表达量的8.1倍。

5种杀菌剂对短短小芽孢杆菌TW-2菌体及芽孢的影响

采用平皿计数法和抑菌圈法研究了5种化学杀菌剂（春雷霉素、三环唑、戊唑醇、稻瘟酰胺和咪鲜胺）对稻瘟病生防菌短短小芽孢杆菌Tw-2菌株（Bacilluspumilus）菌体和芽孢存活的影响。结果表明：供试的5种化学杀菌剂在高浓度下（2000rag／L）可以完全抑制短短小芽孢杆菌Tw-2菌株菌体和芽孢的存活，而低浓度下（0．32-8．00mg／L）对菌体和芽孢的存活影响较小；在5种化学杀菌剂中春雷霉素对短短小芽孢杆菌Tw．2菌株菌体和芽孢存活影响最大，其次依次是咪鲜胺、三环唑、戊唑醇、稻瘟酰胺。研究结果显示：稻瘟病生防菌短短小芽孢杆菌Tw-2菌与供试的5种化学杀菌剂分别混用防治稻瘟病，这5种杀菌剂的浓度应在0．32mg／L以下，否则会影响生防菌的效果。

短短小芽孢杆菌启动子筛选载体的构建

为了筛选短短小芽孢杆菌强启动子元件,应用PCR技术从枯草杆菌168中分离出α-淀粉酶基因,用其作为报告基因与质粒pUB110和pKF3一起构建了启动子筛选载体pKB/A.将短短小芽孢杆菌细胞壁蛋白基因启动子引入该载体构建成重组质粒pKB/PA,电穿孔法转化短短小芽孢杆菌50后发现α-淀粉酶以活性形式分泌表达.结果表明短短小芽孢杆菌启动子筛选载体构建成功.