短短小芽孢杆菌-大肠杆菌穿梭分泌表达载体的构建

应用PCR技术从具有分泌蛋白能力强且没有胞外蛋白酶活性的短短小芽孢杆菌 5 0中分离出细胞壁蛋白基因的多启动子和信号肽编码序列 ,利用它与质粒pUB110和pKF3一起构建成穿梭分泌表达载体pBKE5 0。将α 淀粉酶基因引入该载体转化短短小芽孢杆菌 5 0后 ,发现α 淀粉酶可以活性形式分泌表达。此工作为下一步建立短短小芽孢杆菌高效分泌表达系统奠定了基础。

地衣芽孢杆菌耐高温α-淀粉酶基因在大肠杆菌中的克隆、表达及其产物的分泌

以耐高温α 淀粉酶生产菌地衣芽孢杆菌染色体DNA为模板 ,通过PCR扩增耐高温α 淀粉酶基因 ,将扩增产物 1 9kb的DNA片段插入到pUC1 9质粒中 ,再转化大肠杆菌JM1 0 9,通过在淀粉平板上形成透明圈等方法筛选到一株阳性克隆菌株JM1 0 9(pUAM) ,其表达产物可分泌到培养基中 ,除去菌体的发酵液中每 1 0 0mL酶活可达到 2 7个单位。将发酵上清液浓缩后用冷无水乙醇分级沉淀 ,所得样品进行SDS PAGE分析 ,得到分子质量为 60ku的目的蛋白带。

芽孢杆菌SPA3β-葡聚糖酶基因在大肠杆菌中的表达

将含β-葡聚糖酶基因的重组克隆载体进行亚克隆,用BamHⅠ和XhoⅠ双酶切后,与相同酶切的表达载体pET-30a相连接,构建重组表达载体,在大肠杆菌BL21中表达,蛋白质电泳结果表明在25.0KD处有表达带,酶活力达85.9U·mL-1,为出发菌的31多倍。

浸麻芽孢杆菌-葡聚糖酶基因在大肠杆菌中的表达

将含浸麻芽孢杆菌β-葡聚糖酶基因的重组克隆质粒进行亚克隆,用Bam HⅠ和XhoⅠ双酶切后,与相同酶切的表达载体pET-30a相连接,构建重组表达质粒,在大肠杆菌BL21中表达.蛋白质电泳结果表明在25.0 kD处有表达带,酶活力达60.4 U/mL,为出发菌的30多倍.酶特性研究表明:该酶的最适温度为50℃,最适pH为5.0～7.0;在50℃以下及在不同的pH下(pH 3.0～9.0)处理后较稳定.

短小芽孢杆菌β-1,4-葡聚糖内切酶基因的克隆及在大肠杆菌中的分泌表达

从一株产碱性纤维素酶的短小芽孢杆菌H12中克隆了编码β-1,4-葡聚糖内切酶的基因,对其基因序列及其酶的结构域进行了分析预测,同时将该酶的基因构建于大肠杆菌表达载体pET20b中,获得重组表达载体pET20b-EglA,将其转化至大肠杆菌BL21(DE3)菌株中进行表达。结果表明,该基因大小为1980 bp,共编码659个氨基酸;对β-1,4-葡聚糖内切酶结构域分析表明,该酶由两个不连续的结构域组成,其一为N-端催化结构域,由糖基水解酶家族9组成,其二为C-端底物结合结构域,由碳水化合物绑定结构域家族3组成;平板实验结果表明,β-1,4-葡聚糖内切酶基因在重组大肠杆菌中得到了良好的分泌表达;SDS-PAGE电泳图谱表明该酶的分子大小约为73 kDa。

类芽孢杆菌属β-葡萄糖苷酶在大肠杆菌中可溶性重组表达的优化

目的:β-葡萄糖苷酶在食品工业领域具有广泛的应用价值,但重组表达时容易形成无活性的包涵体。通过传统诱导条件优化无法完全解决包涵体积累问题,需探索新的策略。方法:从类芽孢杆菌属(Paenibacillus sp)基因组中克隆获得了β-葡萄糖苷酶基因bgl,构建到大肠杆菌表达载体p ET28a获得重组质粒p ET-bgl,转化大肠杆菌宿主细胞BL21(DE3)获得重组菌BL-ETbgl,并进行诱导条件优化。进一步通过复制起始位点替换,构建了新型大肠杆菌表达载体p ACYT-bgl,转化大肠杆菌宿主细胞BL21(DE3)后得到改进型重组菌BL-ATbgl。结果:BL-ETbgl经诱导表达后,所表达重组蛋白具有β-葡萄糖苷酶活性。经诱导条件优化后,仍有40%蛋白以包涵体存在。而BL-ATbgl经诱导表达后,可溶性的重组β-葡萄糖苷酶约占80%。自诱导培养基中β-葡萄糖苷酶产量可达2.31×106U/L。结论:通过降低质粒拷贝数、优化培养条件等手段,可以大幅度提高类芽孢杆菌β-葡萄糖苷酶在大肠杆菌中的可溶性表达水平。

地衣芽孢杆菌α-耐高温淀粉酶基因的克隆及在大肠杆菌中的表达

地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)是产生具有重要工业生产价值的耐高温α -淀粉酶(α -amylase)的优良菌株。在提取地衣芽孢杆菌基因组DNA基础上 ,通过PCR方法克隆了耐高温淀粉酶的全长基因1539bp ,与pUCm -T载体连接转化入克隆菌DH5α中 ,经过酶切鉴定筛选出阳性的克隆菌 ,再提取质粒与表达载体pET-28a( +)酶切后连接转化入宿主菌DE3中 ,其阳性重组子在37℃1.0mmol·L-1IPTG诱导下 ,α -淀粉酶的基因得到了较好的表达。表达产物经SDS -PAGE鉴定 ,确定表达蛋白的相对分子量为63000左右 ,与理论推导的分子量相一致。

益生菌-中草药制剂对鸡大肠杆菌的体外抑菌与攻毒保护试验

为研究益生菌-中草药制剂对鸡大肠杆菌病的防控作用,试验从散养草鸡的脾脏和肝脏组织中分离出2株革兰氏阳性杆菌[短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)和巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)],将已活化的2株芽孢杆菌与麦芽、猪苓、茯苓三种中草药制成益生菌-中草药制剂,观察其对鸡大肠杆菌的体外抑制和攻毒保护效果。结果表明:益生菌-中草药制剂对鸡大肠杆菌的抑菌率为94. 7%,对人工感染大肠杆菌的保护率达到87. 5%以上。说明益生菌-中草药制剂对预防鸡大肠杆菌病有良好的效果。

α-淀粉酶在短短芽孢杆菌中的分泌表达

应用PCR技术从枯草杆菌168中分离出α-淀粉酶基因。将其引入分泌表达载体pBKE50后,用Tris-PEG法转入短短芽孢杆菌50中,发现α-淀粉酶以活性形式被分泌表达。酶测活分析表明α-淀粉酶活性约为出发菌枯草杆菌168的1.7倍。

β-半乳糖苷酶重组大肠杆菌诱导表达条件的研究

β-半乳糖苷酶常用于牛奶中乳糖的水解。来源于嗜热脂肪芽孢杆菌的高温β-半乳糖苷酶基因经克隆后转入大肠杆菌T7表达系统得到成功表达。在SOB培养基上分别以IPTG和乳糖为诱导剂,对重组菌的诱导时机、诱导浓度和诱导长度进行研究,β-半乳糖苷酶比酶活分别达到11.5 U/mg和7.7 U/mg,比酶源菌提高90和60倍。

基因工程大肠杆菌合成γ-聚谷氨酸

利用PCR方法,从自身不合成γ-聚谷氨酸(γ-PGA)的Bacillussubtilis168菌的基因组DNA中扩增出γ-PGA合成基因ywsC,ywtA和ywtB,测序并对该基因编码区进行序列分析,比对结果表明,扩增的ywsC,ywtA和ywtB与文献报道的相似度为100%.将3个基因连接到pTrcHisA载体后转化至E.coliTOP10及E.coliBL21(DE3)宿主菌表达,结果宿主菌细胞均具备了γ-PGA生物合成能力,产量最高达到0.134g/L.

重组大肠杆菌产Bacillus subtilis 168来源γ-谷氨酰转肽酶的摇瓶发酵优化

为实现来源于Bacillus subtilis的γ-谷氨酰转肽酶（GGT）高效胞外分泌表达,以基因工程菌E.coli BL21（DE3）/p ET-20b（＋）/ggt为出发菌株,对其发酵产酶的诱导条件和培养基进行优化。最终确定其最优发酵培养基为：10 g/L甘油,21 g/L酵母粉,7 g/L蛋白胨,130 mmol/L磷酸盐;发酵条件为：37℃、200 r/min培养4 h,加入0.2 mmol/L IPTG后转入25℃,诱导40~48 h,优化后酶活达到81.2 U/m L,是未优化前的1.9倍。本研究结果为目前国内报道大肠杆菌摇瓶发酵产γ-谷氨酰转肽酶的最高酶活,为该酶的工业化生产奠定了基础。

内生解淀粉芽孢杆菌TB2内切β-1，4-葡聚糖酶基因的克隆和原核表达分析

以内生解淀粉芽孢杆菌TB2菌株基因组为模板,克隆了该菌的β-1,4-内切葡聚糖酶基因的ORF。测序结果表明该ORF全长1 500 bp,编码499个氨基酸,分子量为55.07 ku,等电点为7.83。Blast同源性分析结果表明,该序列与GenBank登录的1株枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis M28332)纤维素酶核苷酸序列的同源性最高(98%),其氨基酸同源性也达98%,已被GenBank收录(Accession number)。用BamHⅠ和XhoⅠ双酶切目的片段和表达载体pET-29a(+)后相连接,构建重组表达载体pET-glu,并导入BL21细菌中表达。酶学特性表明:SDS-PAGE电泳在59 ku左右有融合蛋白带,该酶的最适反应温度为50℃,最适反应pH为6.4,为中性纤维素酶。实验结果为进一步研究内生解淀粉芽孢杆菌TB2纤维素酶的功能和应用打下了基础。

地衣芽孢杆菌α-淀粉酶基因的克隆与表达

产淀粉酶高温菌在淀粉酶的生产中具有重要意义。从温泉中分离到1株可在60℃快速生长的淀粉酶产生菌A12 ,经16SrDNA序列比较和丙酸盐利用等实验将其鉴定为地衣芽孢杆菌。构建了地衣芽孢杆菌A12基因文库,并从中克隆到一个α -淀粉酶基因amyA1,对其进行了测序分析,并在大肠杆菌中实现了表达。本研究为构建一个耐高温淀粉酶生产用工程菌奠定了基础。

短短小芽孢杆菌启动子筛选载体的构建

为了筛选短短小芽孢杆菌强启动子元件,应用PCR技术从枯草杆菌168中分离出α-淀粉酶基因,用其作为报告基因与质粒pUB110和pKF3一起构建了启动子筛选载体pKB/A.将短短小芽孢杆菌细胞壁蛋白基因启动子引入该载体构建成重组质粒pKB/PA,电穿孔法转化短短小芽孢杆菌50后发现α-淀粉酶以活性形式分泌表达.结果表明短短小芽孢杆菌启动子筛选载体构建成功.

添加产α-淀粉酶大肠杆菌可提高肉鸡性能

土耳其研究人员将嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶基因单独或与透明颤菌血红蛋白基因一起克隆到pUC8载体．并转移到大肠杆菌菌株中形成可以产α-淀粉酶的菌株。用LB肉汤培养并将培养物加入饮水中饲喂肉鸡。饲喂添加大肠杆菌培养物肉鸡的采食量、日增重、饲料转化率都比对照显著提高。此外，还可以显著提高干物质和有机物的表观消化率。显著增加肠绒毛和隐窝的长度，显著提高血清和肠道内容物的淀粉酶活性。研究结果表明，产α-淀粉酶的活大肠杆菌培养物可以起到抗生素生长促进剂的作用，在替代抗生素作为肉鸡生长促进剂方面具有很大的潜力。

特基拉芽孢杆菌L-天冬氨酸α-脱羧酶的异源表达及高密度发酵

L-天冬氨酸α-脱羧酶(L-aspartateα-decarboxylase,Pan D)能选择性脱去L-天冬氨酸的α-羧基生成β-丙氨酸,具有重要的工业应用价值。以特基拉芽孢杆菌(Bacillus tequilensis)Pan D37的基因组为模板,扩增Pan D表达基因panD,构建表达质粒p ET32a(+)-panD,转入Escherichia coli BL21(DE3)成功实现异源表达。利用摇床和发酵罐优化培养条件实现高密度发酵,确定最佳培养条件为:37℃培养8 h,加入终浓度0.5 mmol/L的异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside,IPTG)降温至26℃诱导,采用葡萄糖为碳源并控制初始质量浓度为5 g/L,发酵过程中采用pH-stat方式补料。在此基础上利用5 L发酵罐进行发酵产酶,酶活力最高可达1 109.8 U/m L,OD_(600 nm)达到106.3。全细胞催化100 g/L L-天冬氨酸,反应10 h物质的量转化率为99.2%。构建的重组菌经发酵优化后具有较高的细胞浓度和Pan D活力,为生物法β-丙氨酸的工业化生产与应用提供理论支持。

枯草芽孢杆菌β-葡聚糖酶基因的克隆和表达

背景：β-葡聚糖已广泛用于保健和临床治疗。通过酶水解的方法得到分子量大小适中的β-葡聚糖，这一研究日益受到重视。目的：实验旨在构建高表达β-葡聚糖酶的工程菌。并对该酶活性及热稳定性做出分析，为今后能够利用到临床医学奠定基础。方法：通过克隆得到枯草芽孢杆菌β-葡聚糖酶的基因，利用分子生物学技术将β-葡聚糖酶基因与表达载体pET28b＋构建重组质粒后导入大肠杆菌中构建工程菌株。利用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷诱导其表达目的蛋白，通过镍离子螯合树脂纯化得到目的蛋白。结果与结论：实验成功编码枯草芽孢杆菌β-葡聚糖酶的基因被克隆到大肠杆菌中，并能高效的表达。根据酶活力测定发现，该酶在50-60℃有较高的酶活性，在50℃最高。β-葡聚糖酶在30—40℃保持较高的热稳定性。实验初步发现，β-葡聚糖酶的工程菌表达产物能分解它的底物，但是否适用于临床治疗需要进行更多的研究。

高温乳糖酶基因在大肠杆菌中的高效表达

来源于嗜热脂肪芽孢杆菌 (Bacillusstearothermophilus)的 β -半乳糖苷酶基因bgaB经克隆、测序后 ,转入大肠杆菌高效表达载体pET - 2 0 (b)中。重组菌在IPTG诱导下 ,表达出的重组蛋白比酶活量为 6 6 6U/mg ,比出发菌株高 5 0倍。

短小芽孢杆菌β-内酰胺酶基因的克隆

以质粒pSC101为载体,用鸟枪法将短小芽孢杆菌A3染色体的β—内酰胺酶基因,克隆至大肠杆菌HB101。经质粒检测及酶切电泳分析证明,克隆的β—内酰胺酶基因位于2.6kb的EcoRI片段上,将此片段连接到质粒PAL32转化枯草杆菌,亦能表达并向胞外分泌β—内酰胺酶。