CD59特异位点的短肽封条对HeLa细胞凋亡作用的研究

目的:研究CD59特异位点的短肽封条对HeLa细胞凋亡相关基因(survivin、caspase-3及bax)的表达作用,探讨CD59特异位点的短肽封条促HeLa细胞凋亡的作用机制。方法:将CD59特异位点的短肽封条分别作用于HeLa细胞和转CD59基因的HeLa细胞。作用24 h后,采用MTT的方法来检测细胞增殖抑制率;并利用免疫组织化学方法检测sur-vivin,caspase-3及其bax的表达水平。结果:转CD59基因的HeLa细胞+短肽的细胞组增殖抑制率大于HeLa细胞+短肽组(P<0.01)。转CD59基因的HeLa细胞+短肽组和正常的HeLa细胞+短肽组相比较,survivin表达水平降低(P<0.05);而caspase-3表达水平增高(P<0.05);bax的表达量各组比较,差别无统计学意义。结论:CD59特异位点的短肽封条具有下调survivin的表达,活化caspase-3,从而促进HeLa细胞的凋亡。

CD59位点短肽封条对HeLa细胞凋亡相关基因caspase-3和survivin作用

目的检测CD59位点短肽封条对HeLa细胞凋亡相关基因caspase-3、survivin表达水平的影响,探讨CD59位点短肽封条促肿瘤细胞凋亡的可能机制。方法将CD59位点短肽封条作用于HeLa细胞,利用免疫组织化学方法检测短肽封条作用12 h和24 h后HeLa细胞caspase-3、survivin的表达水平。结果caspase-3表达随短肽封条剂量和作用时间的增加而增加;survivin表达随短肽封条的剂量和作用时间的增加而减少。结论CD59位点短肽封条能下调survivin的表达并活化caspase-3,从而可能导致HeLa细胞的凋亡。

CD59特异位点短肽封条对T细胞封闭作用

目的探讨含有CD59特异位点的短肽封条对T细胞的封闭作用及其可能机制。方法建立HeLa肿瘤小鼠模型,眼球取血分离血清测定补体C3、C4,分离培养鼠胸腺T淋巴细胞、分别加入CD59-mAb、CD59特异位点短肽封条作用48h后,MTT法检测T细胞增殖情况。结果肿瘤小鼠补体C3、C4含量明显降低(t=30.970、16.789,P<0.01);CD59-mAb对T细胞增殖起促进作用,而含有CD59特异位点的短肽封条能抑制T细胞增殖,两者的作用与正常对照相比差异有显著性(t=5.428、4.726,P<0.01)。结论CD59参与T细胞信号转导而与补体抑制作用无关,含有CD59特异位点的短肽封条对T细胞起封闭作用。

利用噬菌体肽库筛选与人CD59特异性结合的短肽

目的:筛选并鉴定与人CD59分子特异结合的短肽,为设计具有拮抗CD59肿瘤逃逸活性的短肽封条奠定基础。方法:以高表达人CD59的中国仓鼠卵巢细胞(CHO)为靶细胞,采用竞争结合试验,对噬菌体随机12肽库进行5轮亲和筛选。用ELISA筛选噬菌体阳性克隆并对其进行DNA序列分析。结果:随机挑选的16个克隆中,有8个与人CD59的结合力高。测序后,得到3个高度同源的氨基酸序列。DNAstar分析显示,3个序列均与已公布的(PubMed)人CD2的氨基酸序列有一定的同源性。结论:获得的序列H×A××××××P××为设计肿瘤逃逸相关的CD59活性位点的短肽封条提供了技术基础。

CHO细胞表面与人CD59结合的活性短肽序列的筛选

目的筛选获得高表达人CD59中国仓鼠卵巢细胞(CHO)表面与人CD59特异性结合的短肽序列,为下一步研究与肿瘤逃逸相关的CD59活性位点的短肽药物提供实验依据。方法以离子层析柱纯化的CHO细胞的裂解蛋白纯蛋白为靶分子分别进行5轮亲和筛选,并进行竞争结合实验,双夹心ELISA方法鉴定噬菌体阳性克隆。提取阳性单克隆单链DNA测序,并推导出短肽序列。结果随机挑选的16个单克隆中有10个克隆对CHO细胞纯蛋白有特异性结合力,经测序得到两条高度同源的多肽序列。结论通过噬菌体随机肽库对CHO细胞进行纯蛋白筛选得到了能与人CD59特异性结合的短肽序列。

下调CD59的表达可以抑制HeLa细胞增殖并促进其凋亡

目的采用RNA干扰与噬菌体肽库展示技术2种方法干预宫颈癌HeLa细胞CD59的表达,以探讨比较2种CD59低表达方式对HeLa细胞增殖与凋亡的影响。方法将10μg/mL的CD59短肽封条作用于HeLa细胞8 h后,联合CD59干扰质粒pSUPER-siCD59稳定转染HeLa细胞系,采用MTT法检测各组细胞增殖率的变化,采用TUNEL染色、annexin V-PE/7-AAD染色结合流式细胞术检测细胞凋亡。结果 CD59短肽封条组与pSUPER-siCD59质粒稳定转染细胞组HeLa细胞增殖明显弱于对照组,TUNEL及流式细胞术检测结果显示2组处理细胞均存在细胞凋亡现象,且短肽封条的效果要好于pSUPER-siCD59质粒。结论下调CD59表达能抑制其细胞增殖并促进其凋亡,且短肽封条效果要优于CD59 RNA干扰质粒。