短肽库中血管内皮细胞生长因子受体Flt-1拮抗剂筛选条件的改进

目的 :改进噬菌体肽库的筛选条件 ,提高筛选阳性率及阳性克隆重复性。使血管内皮细胞生长因子受体Flt 1拮抗剂的筛选更为有效。方法 :通过对血管内皮细胞生长因子受体Flt 1的原核表达产物的变性复性处理 ,获得相对纯化的可溶性Flt 1受体。将该可溶性受体固相化 ,对噬菌体表达 12肽库进行 4～ 5轮Bio panning后 ,挑取单个噬菌斑制备高滴度噬菌体上清。用ELISA法初步鉴定各噬菌体克隆与sFlt 1的特异性结合并测定阳性克隆的DNA顺序。在Bio panning过程中增加非特异性蛋白的预吸附 ,并减少输入噬菌体数量 ,再次筛选短肽库。结果 :经过第一次筛选 ,获得了一系列具有一定重复性与同源性的噬菌体克隆。改进筛选条件后 ,筛选阳性率由2 %提高到 8.3% ,阳性克隆的重复性也得到显著提高。该高重复阳性克隆的氨基酸顺序与前一次筛选获得的阳性克隆有较高同源性。结论 :Bio panning条件的改进提高了筛选效率 ,为不纯蛋白筛选短肽库积累了经验 ,并为血管内皮细胞生长因子受体拮抗剂的研制奠定了基础。

噬菌体短肽库的构建及其随机短肽的多样性

噬菌体短肽库是将随机合成的寡核苷酸序列通过与单链噬菌体外壳蛋白基因融合，从而将随机短肽表达于噬菌体的表面。将体外随机化学合成的寡聚核苷酸序列重组到单价噬菌体表达载体，构建了噬菌体短肽库，证明其库容为２×１０￣７集落形成单位（ｃｆｕ），重组率为９３％。同时将１１个随机克隆进行序列测定，证实其寡聚核苷酸序列和氨基酸的分布几乎是完全随机的，其多样性可以满足特异性短肽筛选的要求。

从噬菌体短肽库中筛选单克隆抗体识别的抗原表位

将随机合成的寡聚核苷酸重组到噬菌体表面单价表达载体，构建了噬菌体随机八肽库。以抗原识别性明确的单克隆抗体９Ｅ１０固相化，对噬菌体短肽库进行了４～５轮“吸附－洗脱－扩增”的筛选，任选多个所获克隆进行ＥＬＩＳＡ检测。发现第４轮后６／２２个克隆可与９Ｅ１０结合，第５轮后１０／１０可与９Ｅ１０结合，此结合反应可被９Ｅ１０所针对的十肽抗原以及游离的９Ｅ１０特异性抑制。对所获阳性克隆进行ＤＮＡ序列测定发现，它们的序列可分为两种，其中一种序列与ｃ－ｍｙｃ十肽具有同源序列ＩＳＥｘｘＬ，而另一种的序列则完全不同。证实噬菌体表面单价表达体系用于构建噬菌体短肽库的有效性，为进一步筛选其它的具有高亲和力的特异性短肽打下了基础。

从噬菌体短肽库中筛选模拟乳腺血清抗原表位

目的： 从１５ 肽 ＰⅢ融合噬菌体库中筛选乳腺血清抗原（ Ｍ Ｓ Ａ） 的模拟表位， 并验证免疫 Ｐ Ｃ Ｒ 筛选法是否与传统的 Ｅ Ｌ Ｉ Ｓ Ａ 筛选方法具有一致的结果。方法： 用 Ｍ Ｓ Ａ 的特异单克隆抗体３ Ｅ１２ 作 “诱饵”， 亲和选择法（ｐａｎｎｉｎｇ ） 富集特异噬菌体， 用 Ｅ Ｌ Ｉ Ｓ Ａ 及免疫 Ｐ Ｃ Ｒ 法挑选阳性克隆并验证特异性。结果： 经过四轮ｐａｎｎｉｎｇ ， 特异噬菌体产出率约为第一轮的１８８倍， 说明抗体３ Ｅ１２ 对噬菌体进行了选择性富集。选出了１０ 个 Ｅ Ｌ Ｉ Ｓ Ａ 反应呈明显阳性克隆， 其中４ 个克隆能抑制天然 Ｍ Ｓ Ａ 抗原抗体的结合。免疫 Ｐ Ｃ Ｒ 的筛选结果与前者基本一致， 但竞争抑制试验中， 未能达到理想效果。结论： 推测这４个克隆表达的短肽与抗体３ Ｅ１２ 识别的表位具有一致或相似的结构。免疫 Ｐ Ｃ Ｒ 的筛选法可以同 Ｅ Ｌ Ｉ Ｓ Ａ 方法结合起来作为常规方法之一， 但它不适于做竞争抑制试验。

噬菌体显示技术在短肽库中的应用现状

噬菌体显示技术是近年来出现的一种新技术,它是将外源蛋白通过与丝状噬菌体外壳蛋白融合而将外源蛋白表达于噬菌体颗粒的表面。该技术已经被广泛地应用于噬菌体短肽库的构建。由于该表达的短肽可以与其相应的结合分子相识别而发挥其生物活性,因而,噬菌体短肽库技术在分子间识别机理的研究、蛋白工程的改造以及药物的筛选、疫苗的研制等方面具有广泛应用前景。本文综述了近年来噬菌体显示技术在短肽库中的应用进展。

识别9E10单抗的噬菌体短肽的免疫学特性分析

为分析从单价表达短肽库中筛选到的两种克隆的免疫学特性，将单价噬菌体短肽表达载体中的ｇⅢ片段切除，在大肠杆菌中表达可溶性短肽分子，ＥＬＩＳＡ竞争抑制实验证实，可溶性短肽分子可竞争抑制９Ｅ１０单抗与Ｃ－ｍｙｃ＋肽结合。进一步将噬菌体短肽的单价表达载体改建为多价表达载体，分别免疫兔和小鼠，制备免疫抗血清，ＥＬＩＳＡ实验和竞争抑制实验结果证实，两种克隆的免疫抗血清均可与９Ｅ１０单抗所识别的抗原表位结合，表明这两个克隆尽管在序列上与原自然抗原不同，但其在结构上真正模拟了ｃ－ｍｙｃ＋肽的抗原表位，在体内可诱发相似的免疫反应。

随机十肽库的构建及血管形成素结合肽的筛选

将合成的含有随机序列 (NNK) 10 的寡核苷酸片段 ,克隆入噬菌体呈现载体噬菌粒pCANTAB5E的SfiⅠ ,NotⅠ位点 ,即cpⅢ蛋白信号肽与成熟肽之间 ,电转化E .coliTG1,构建了噬菌体表面呈现的十肽库 ,实际库容为 3 5 3× 10 7,插入率为 6 6 7% .经辅助噬菌体M13KO7超感染后 ,获得滴度为 4 8× 10 11pfu/ml的噬菌体上清 .经过两轮panning筛选和富集 ,从构建的随机十肽库中筛选到 2 6个具有血管形成素结合活性的重组噬菌体克隆 ,对其中 12个阳性噬菌体克隆的短肽序列进行了分析 ,ELISA检测结果显示

胃癌相关抗原表位模拟短肽的筛选

目的 :筛选能模拟胃癌相关抗原表位的功能短肽。方法 :利用离子交换层析 ,对抗胃癌相关抗原单克隆抗体 (mAb)进行纯化 ,并以此mAb为靶标 ,将其包被于ELISA板上 ,以噬菌体随机 12肽库对其进行 3轮亲和筛选。结果 :从噬菌体随机12肽库中 ,筛选到 12个噬菌体阳性克隆。结论 :获得了具有模拟胃癌相关抗原表位的阳性噬菌体克隆 。

结合酪氨酸蛋白激酶受体EphB2的功能短肽的筛选

目的筛选能结合酪氨酸蛋白激酶受体 Eph B2的功能短肽。方法 PCR扩增 Eph B2的配体结合区 ,定向克隆到融合表达质粒载体 p RSET A中 ,阳性克隆经 IPTG诱导表达融合蛋白 ,并利用 Ni- NTA金属螯合亲和层析在变性条件下对表达的蛋白进行纯化 ,以此纯化蛋白为靶 ,将其包被于 EL ISA板上 ,进行 3轮亲和筛选。结果电泳分析表明 :表达的融合蛋白主要以包涵体的形式存在 ,纯化蛋白质的纯度大于 95 %。从噬菌体随机 12肽库中筛选到 13个噬菌体阳性克隆。结论获得了具有结合 Eph

噬菌体展示法筛选抗人PTA1单克隆抗体结合肽

目的从噬菌体展示文库中筛选能与抗人PTA1单克隆抗体(mAbs)特异性结合的短肽。方法采用protein-A亲和层析法纯化系列抗人PTA1mAbs，通过流式细胞术检测筛选出能够阻断PTA1-Fc融合蛋白与其天然配体结合的mAb，经过三轮亲和筛选，从噬菌体随机12肽库中筛选可特异性结合mAb的重组噬菌体阳性克隆，进而对这些克隆的短肽序列进行测定和分析。结果确定了能够阻断PTA1-Fc融合蛋白与其天然配体结合的mAb为LeoA1，得到了13个具有特异性结合LeoA1的重组噬菌体阳性克隆，序列测定结果发现，这些可结合LeoA1的短肽，有较保守而集中的模式序列，即WPXHHX序列。结论这些具有保守模式序列的短肽，有可能模拟PTA1分子的功能表位，成为其天然配体拮抗剂的候选肽段。此外，PTA1分子与其配体结合的功能表位的确定，也为今后寻找天然配体和进一步深入研究PTA1分子的结构和功能提供了实验依据。

利用噬菌体展示筛选结合水稻条叶枯病毒S蛋白的短肽

利用噬菌体展示技术在随机 7肽库中筛选到结合水稻条叶枯病毒 (ricestripevirus ,RSV)病害特异蛋白(stripedisease specificprotein ,S蛋白 )的 6个短肽 ,并进行了序列测定 .ELISA结果表明 ,6个短肽和S蛋白具有一定的亲和能力 .筛选到的短肽对今后S蛋白功能分析、转基因抗RSV和水稻条叶枯病的诊断提供了条件 .