甘蔗核心种质花叶病和宿根矮化病自然抗病性调查与分子检测

抗病种质资源的发掘利用是抗病育种的基础和关键,筛选抗病种质对选育抗病品种具有重要意义。为明确国家甘蔗种质资源圃保存的核心种质花叶病和宿根矮化病病情及其自然抗病性,本研究于2021年,对国家甘蔗种质资源圃保存的105份甘蔗核心种质进行花叶病和宿根矮化病田间自然发病调查及其病原检测与抗性评价。结果表明,105份核心种质中,花叶病1级高抗到3级中抗的有75份,占71.4%;105份核心种质样品检测到SCSMV、SrMV两种病毒,所有样品均未检测出SCMV病毒;38份核心种质受SCSMV单独侵染检测出SCSMV、检出率为36.2%,15份核心种质受SrMV单独侵染检测出SrMV、检出率为14.3%,20份核心种质受SCSMV和SrMV复合侵染检测出SCSMV和SrMV、检出率为19.0%;105份核心种质中88份感RSD呈阳性、阳性检出率为83.8%,17份未感RSD呈阴性、占总检测数的16.2%。综合分析结果显示,21份核心种质对SCSMV和SrMV 2种病毒均表现为高抗,占20.0%;27份核心种质双抗SCSMV和SrMV 2种病毒,占25.7%;17份核心种质抗RSD,占16.2%;其中11份核心种质多抗SCSMV、SrMV和RSD,占10.5%。研究结果明确了105份甘蔗核心种质花叶病和宿根矮化病田间病情及其病原类群,筛选出11份多抗SCSMV、SrMV和RSD核心种质,为深入开展甘蔗抗病育种提供了抗病基因源和参考依据。

我国华南蔗区甘蔗宿根矮化病的PCR分子检测

宿根矮化病Ratoon stunting diseases(RSD)是由木质部限制性赖氏细菌木质部变种Leifsonia xyli subsp.xyli(Lxx)引起的一种主要甘蔗细菌性病害之一,在世界各甘蔗产区普遍发生。为明确我国主要蔗区RSD发生率和收获方式对RSD发生率的影响,本文从广东和福建的罹病甘蔗蔗茎样品成功分离获得病原细菌,基于细菌16S核糖体和16-23S核糖体间隔序列(ITS)证实为Lxx。随后,从广西、广东和福建主要蔗区采集甘蔗品种蔗茎样品1446份,以靶标16-23S核糖体ITS区域的Lxx-F/Lxx-R为检测引物,开展RSD分子检测。结果表明,福建蔗区RSD检出率较低,为0~9.4%,广西、广东蔗区RSD检出率分别为20.4~85.2%和82.1%,尤其是广西龙州县和广东遂溪县蔗区,RSD检出率高达80%以上。在机械收获和人工砍刀收获方式下的宿根蔗蔗茎样品RSD检出率没有显著差异。本研究结果为我国蔗区RSD的科学防控提供依据。

云南耿马甘蔗宿根矮化病的发生分布和病原分子检测

为摸清云南耿马甘蔗宿根矮化病的发生分布,为甘蔗温水脱毒健康种苗生产和推广应用提供科学依据,本研究对云南耿马不同甘蔗品种植期的80个样本进行宿根矮化病菌分子检测。结果表明:61个样本为阳性,阳性检出率76.25%,其中强阳性样本34个,占42.50%;10个主栽或主推品种均发病,发病率在37.50%~100%之间,以粤糖93-159、粤糖83-88、云瑞07-1433、盈育91-59、柳城05-136发病最重,发病率为77.27%~100%,强阳性率为44.44%~66.67%,其次是新台糖22号、云瑞06-189、云瑞10-328、云蔗05-51和云蔗08-1609,发病率为37.50%~100%,强阳性率为0%~14.29%;植期上1~5年均不同程度发病,但无明显的规律性差异。本研究检测表明甘蔗宿根矮化病已在云南耿马蔗区普遍发生且危害严重,急需生产和推广种植甘蔗温水脱毒健康种苗,以促进蔗糖产业的可持续高质量发展。

云南澜沧不同甘蔗品种植期宿根矮化病菌检测分析

甘蔗宿根矮化病(Ratoon Stunting Disease,RSD)是严重影响蔗糖产业高质量发展的一种种传甘蔗病害。摸清不同甘蔗品种植期RSD的感染情况,是科学推广温水脱毒种苗,有效防控RSD的关键。本文对云南澜沧蔗区RSD的发生和分布进行了调查和田间采样,采用PCR法,对田间采集的124个样本进行RSD检测。结果表明:73个样本为阳性,阳性检出率58.87%,其中强阳性样品42个,占33.87%;15个主栽和主推品种均发病,发病率在28.57%~100%之间,以云引58号、粤糖82-882和德蔗09-84发病最重,发病率和强阳性率均高达100%,其次是粤糖93-159和粤糖00-236,发病率分别为90.00%和87.5%;植期上1~6年均不同程度发病,但无明显的规律性差异。本研究检测明确了澜沧蔗区不同品种植期RSD发生状况,为应用推广温水脱毒种苗、有效防控RSD提供了科学依据。

甘蔗宿根矮化病病原菌致病因子pglA基因的序列分析与原核表达

多聚半乳糖醛酸内切酶(endo-PG)是植物与微生物互作中极其重要的细胞壁降解酶,是病原菌定殖寄主与产生致病性的必需因子,革兰氏阴性菌Leifsonia xyli subsp. xyli (Lxx)是甘蔗宿根矮化病的致病菌,pglA是Lxx的关键致病因子。为了揭示pglA基因的功能,本研究采用重叠延伸PCR的方法获得了pglA基因的开放阅读框(ORF),ORF长1491 bp的,编码496个氨基酸,序列保守结构域包含Gly_hydro_28 (Polygalacturonase)与Rho超家族,与Lxx CTCB07、Lxc DSM46306归为一类,相似性达100%。氨基酸序列分析显示,pglA蛋白属于疏水性蛋白,包含信号肽和跨膜区。在大肠杆菌中表达纯化获得pglA蛋白,以包涵体的形式存在于菌体中。研究结果为进一步进行Lxx的致病机制研究奠定了基础。

宿根矮化病菌诱导甘蔗差异表达基因的cDNA-SCoT分析

宿根矮化病是危害严重的世界性甘蔗主要病害之一，为了探究甘蔗在该病胁迫下的抗病分子机制，本研究以甘蔗品种新台糖22健康植株为材料，利用含有宿根矮化病病原菌的蔗汁诱导其抗性，分别在接种后2、4、6、8和10d取样，构建宿根矮化病侵染处理与对照的RNA混合池，利用cDNA-SCoT法进行差异显示研究。结果表明，80条SCoT引物扩增出500多条带，长度在100～1800bp之间。从中筛选出30个差异明显的条带，测序后序列拼接，获得22条高质量的EST序列。生物信息学分析显示，对甘蔗宿根矮化病的差异基因主要涉及能量代谢、防卫反应、信号转导、蛋白质类代谢等方面。进一步基因功能分析显示，油菜素内酯合成蛋白、NBS-LRR类抗性蛋白、茉莉酸诱导蛋白、α-微管蛋白、ABA胁迫成熟蛋白、富含脯氨酸蛋白、翻译起始因子eif-2b α亚族等可能参与了甘蔗宿根矮化病病原菌互作的过程。

甘蔗花叶病和宿根矮化病多重PCR检测方法的建立

【目的】建立能同时检测甘蔗花叶病(sugarcane mosaic virus,SCMV)和宿根矮化病(ratoon stunting disease,RSD)的多重PCR检测方法。【方法】以病株带鞘叶组织总核酸反转录物为模板,根据中国甘蔗花叶病的主要致病病原高梁花叶病毒SrMV和甘蔗花叶病毒中国大陆优势株系SCMV-A,结合B、D、E和SC株系的外壳蛋白核苷酸序列的保守区设计PCR引物对和已有的检测甘蔗宿根矮化病病原木质部赖氏杆菌木质部亚种(Leifsonia xyli subsp.Xyli,Lxx)的PCR引物对,在SCMV RT-PCR和RSD单一PCR体系的基础上,建立并优化可同时检测SCMV和RSD的多重PCR检测方法。【结果】此检测方法可特异地从感染SCMV和RSD的样品中扩增出SCMV(400 bp)和RSD(265 bp)2个条带,扩增产物测序结果表明,SCMV扩增产物与GenBank中其它株系或分离物的核苷酸序列同源性为81%～99%,RSD扩增产物与GenBank中其它株系或分离物的核苷酸序列同源性为91%～99%。【结论】应用此检测方法可稳定、特异地检测出蔗株中是否有导致甘蔗花叶病和宿根矮化病的单一或混合的病原。

甘蔗宿根矮化病PCR检测技术优化分析

【目的】在PCR的基本程序上,以甘蔗宿根矮化病菌Lxx16S～23S rDNA内部转录间隔区特异性引物,优化PCR反应条件,以建立稳定、快速、灵敏度高的甘蔗宿根矮化病PCR检测技术。【方法】以Lxx基因组DNA为模板,采用TaKaRa的Ex Taq Polymerase和2×GCBufferⅡ,调整退火温度和引物浓度等主要因子,优化PCR反应体系;稀释Lxx基因组DNA模板的浓度,检测优化PCR的灵敏度;用优化的PCR对田间生长的甘蔗品种GT11叶片总DNA进行RSD测定。【结果】优化的PCR得到清晰特异的条带为Lxx16S～23S rDNA内部转录间隔区序列;能从稀释1000倍的Lxx基因组DNA(15.9pg/μL)中检测到Lxx,而常规的PCR只能从稀释100倍的Lxx基因组DNA(159pg/μL)中检测到Lxx,且出现假阴性,不稳定。对田间生长的甘蔗品种GT11叶片总DNA进行PCR检测,结果用优化后的PCR检测RSD感染率为66.7%,而常规的PCR检测RSD感染率为0。【结论】优化的PCR体系为:2×GCBufferⅡ12.5μL,Ex Taq DNA酶(5U/μL)0.2μL;dNTP(2.5mmol/L)1.5μL;Lxx1(10μmol/L)1.0μL,Lxx2(10μmol/L)1.0μL,DNA模板1.0μL,用ddH2O双蒸水补足至25.0μL。PCR反应程序为:95℃预变性10min,94℃15s,57℃15s,72℃30s,40个循环;72℃延伸10min。优化的PCR比常规PCR的灵敏度高、结果稳定、检测效率高,更适合于田间大批量样品快速检测。

甘蔗宿根矮化病(RSD)温水脱菌研究

为寻求甘蔗宿根矮化病（RSD）的有效防控技术和方法，本研究根据甘蔗RSD的传播危害特点，选择五大主栽品种，采用温水处理设备对带菌蔗种进行温水（50±0．2℃）脱菌处理2h，分析研究温水处理对甘蔗RSD的脱菌效果。结果表明：温水（50±0．2℃）脱菌处理2h能有效去除甘蔗RSD，去除率为90％以上。与常规种苗相比，脱菌种苗在整个生长期中都表现出明显的生长优势，早生快发、伸长拔节早、长相健壮。粤糖93／159、ROC25号、ROC10号、闽糖69／421、桂糖17号5大主栽品种经温水脱菌处理均具有显著的增产增糖效果：新植增产甘蔗5．01～49．83t／hm^2，增幅5．97％-91．31％；甘蔗蔗糖分提高0．07％～0．86％（绝对值）。可见，种植温水脱菌种苗是防治甘蔗RSD最经济有效的措施，在生产上应加快推广，使之制度化，可大幅度提高甘蔗的产量和糖分，延长宿根年限，从而显著提高甘蔗生产的经济效益。

甘蔗宿根矮化病菌PCR检测及目的片段核苷酸序列分析

根据甘蔗宿根矮化病(RatoonStuntingDisease,RSD)病原细菌(Leifsoniaxylisubsp.xyli,Lxx)16S-23SrDNA基因间隔区核苷酸序列设计的一对特异性引物,建立了甘蔗宿根矮化病PCR检测方法;同时对PCR扩增的目的片段核苷酸序列进行测定与分析。结果表明广东湛江蔗区RSD病菌16S-23SrDNA基因间隔区核苷酸序列与巴西、澳大利亚及美国路易斯安娜州RSD株系基因组相应区段核苷酸同一率接近100%,病菌高度的同源。而与近缘的木质部赖氏杆菌狗牙根变种(Leifsoniaxylisubsp.Cynodontis,Lxc)和形态上相近的马铃薯环腐病菌(Clavibactermichiganensissubsp.Michiganensis)基因组相应区段核苷酸同一率较低,存在明显的分化。

广西主要蔗区甘蔗宿根矮化病调查

【目的】调查广西主要蔗区甘蔗宿根矮化病(Ratoon stuning disease,RSD)的发生情况,了解其分布、危害程度及发生规律,为推广甘蔗健康种苗,有效防控RSD提供科学依据。【方法】2013~2014年在广西9个糖料蔗主产区进行RSD发生情况调查和田间取样,采用PCR对采集的蔗茎样品进行RSD检测,并按不同蔗区、不同品种、不同植期、不同蔗地类型的发病率分析广西蔗区RSD发生状况。【结果】在278个样品中有198个样品检测出RSD,检出率为71.2%;调查的9个主产区均检测出RSD,阳性检出率在58.3%~100.0%;采集的27个甘蔗品种(系)均检测出RSD,其中主栽品种ROC22发病严重,RSD检出率达80.8%;新植蔗的RSD检出率为36.0%,宿根蔗的RSD检出率为75.7%,宿根年限越长,RSD检出率越高;旱地蔗的RSD发病率比水田高18.1%(绝对值)。【结论】RSD在广西普遍发生且发生严重,生产中急需推广甘蔗温水脱毒种苗和选育高抗且综合性状优良的甘蔗品种。

应用DB-EIA技术快速检测甘蔗宿根矮化病研究

就甘蔗宿根矮化病DB-EIA检测技术、检测灵敏度、样品蔗汁保存方式及保存时间进行研究。结果表明DB-EIA检测甘蔗宿根矮化病具有操作简单、高效、重复性好、灵敏度高、对蔗汁新鲜度要求不高等优点。该方法检测灵敏度为1～1/10(稀释倍数);蔗汁保存于4℃或-20℃条件下3d,对检测结果无显著影响,-20℃条件下保存45d,大部分样品检测结果不受影响,少部分样品出现假阴性。

宿根矮化病菌对甘蔗生长和内源激素的影响

甘蔗宿根矮化病(ratoon stunting disease,RSD)是由Leifsonia xyli subsp.xyli引起的病害。为研究该病对甘蔗的生长和内源激素的影响,选择2个甘蔗品种新台糖22号(ROC22)和果蔗(Badila),采用桶栽种植分别进行3个处理:感染RSD病菌蔗株进行52℃温汤脱菌处理30 min、感染RSD病菌蔗株、健康蔗株(对照),在出苗后90、120、150、180 d测定株高和内源激素的含量,并利用PCR检测确定感病和健康蔗株。结果表明:感染RSD病菌蔗株的株高显著低于对照和温汤脱菌处理;感染RSD病菌处理植株的赤霉素(GA3)、生长素(IAA)含量明显低于对照和温汤脱菌处理,而脱落酸(ABA)含量则相反,感染RSD病菌处理的ABA含量明显高于对照和温汤脱菌处理;对照和温汤脱菌处理的株高和激素含量差异不显著。

番禺果蔗宿根矮化病调查及分析

为明确广州市番禺果蔗主产区甘蔗宿根矮化病的发生情况,利用PCR技术,对随机采自番禺区农户和本所试验地120个果蔗样品进行检测。结果表明:黑皮果蔗的RSD检出率为93%,黄皮果蔗的RSD检出率为95%,果蔗健康种苗的RSD检出率为0%。果蔗健康种苗有效的去除了甘蔗宿根矮化病,推广果蔗健康种苗可促进果蔗产业健康发展。

云南双江蔗区甘蔗宿根矮化病的调查及病原检测

甘蔗宿根矮化病(Ratoon Stunting Disease,RSD)是一种世界性的重要甘蔗病害,对甘蔗生产危害极大。摸清蔗区RSD的分布、发生危害情况,是科学推广温水脱毒健康种苗,有效防控甘蔗宿根矮化病的关键。对云南双江蔗区甘蔗宿根矮化病的发生和分布进行了调查和田间采样,采用PCR和I-ELISA法,对田间采集的60个样本进行RSD检测。结果表明,51个样本为阳性,阳性检出率85%,9个样本为阴性,确认双江蔗区存在RSD;通过系统分析,明确了不同品种、不同植期、不同蔗地RSD发生状况,为双江蔗区推广应用温水脱毒健康种苗、有效防控甘蔗宿根矮化病提供科学依据。

甘蔗宿根矮化病研究进展

甘蔗宿根矮化病(Ratoon stunting disease,RSD)是由一种木质部限制性病原菌引起的病害,感染RSD的蔗株一般表现为植株矮化、分蘖少、生长缓慢,成熟蔗茎基部节位维管束组织一般呈粉红色至橙红色等变色症状。被染污的收割工具很容易将病菌传染给健康蔗株而使RSD迅速传播蔓延。酶免疫方法和PCR方法是检测RSD的常用方法,各有优缺点。用于RSD病原细菌培养的培养基有多种,使用最多的是SC培养基。选育抗RSD品种和健康种茎生产体系相结合是防治RSD最有效的措施。对RSD的基因分析已有一定进展,建议进一步利用基因组学和蛋白质组学分析方法进行研究。

甘蔗健康苗圃宿根矮化病检测及结果分析

甘蔗宿根矮化病(Ratoon Stunting Disease,RSD)是中国蔗区的一种主要甘蔗病害,影响甘蔗产量、蔗糖分及宿根蔗年限,也是导致甘蔗品种种性退化的重要原因之一,具有较严重的经济危害性。笔者应用实验室建立的甘蔗宿根矮化病菌PCR检测技术对1级或2级健康种苗圃种苗进行甘蔗宿根矮化病监测,以明确各级种苗圃宿根矮化病发生情况,为指导生产提供科学数据。检测结果为‘粤糖00-236’和ROC22新植1级和2级健康种苗圃均未检测出RSD,宿根1级健康种苗圃RSD检测率分别为20%和5%,各级健康种苗圃RSD总检出率分别为6.7%和2%,分别较其普通种茎苗RSD检出率降低86.6%和68%。结果表明,建立的甘蔗健康种苗圃已有效地去除了甘蔗RSD病菌。

热水处理防治甘蔗宿根矮化病的效果及对再生植株影响研究

甘蔗宿根矮化病(Ratoon Stunting Disease,RSD)在我国蔗区普遍发生,研究其防治方法十分必要。应用50℃2 h热水处理严重感染RSD的粤糖00-236,新台糖22号种茎,用斑点酶标记免疫试验(Dot blot en-zyme immunoassays,DB-EIA)检测RSD病原菌(Leifsonia xylisubsp.xyli,Lxx),研究热水处理脱菌效果;并以粤糖00-236热水处理种茎与未处理种茎进行田间对比试验,研究热水处理对种茎再生植株的影响。结果表明:50℃2 h热水处理种茎可极显著的杀死感病种茎中的RSD病原细菌Lxx,对RSD有较好的防效,但不能彻底去除感病种茎中的Lxx。与未经热水处理种茎再生植株相比,经热水处理的粤糖00-236感病种茎再生植株的茎长、节间长度、一茎重显著增加,有效茎数极显著增多,生长速度加快,蔗茎产量增加23.2%,但成熟期甘蔗品质几乎无差异。另外,热水处理对种茎蔗芽有损伤,降低了种茎萌芽率。结果表明:50℃2 h热水处理甘蔗种茎能有效的防治甘蔗RSD,促进甘蔗生长,具有显著的增产效应。

甘蔗叶片宿根矮化病的PCR检测

采用PCR方法对甘蔗植株不同生长时期(幼苗期、分蘖期、拔节期、成熟期)、同一植株的不同叶片及同一叶片的不同部位(叶尖、叶中、叶基)分别取样进行宿根矮化病检测。结果表明:在不同甘蔗生长时期常规PCR方法都可以检测出宿根矮化病阳性植株;对呈阳性植株的不同叶片及同一叶片的不同部位检测均呈阳性,说明被检测甘蔗品种植株不同位置叶片对甘蔗宿根矮化病检测效率影响差异不明显。

甘蔗种质资源抗宿根矮化病特性鉴定

【目的】筛选抗甘蔗宿根矮化病(RSD)种质资源材料,为选育抗RSD甘蔗品种提供优良抗原。【方法】采用浸蔗种的方法对6个系列100份甘蔗品种进行侵染,用建立的RSD-PCR检测方法进行检测,计算各甘蔗品种RSD发病率,并对甘蔗种质资源进行抗性评价。【结果】100份甘蔗品种材料中,GT02/351、CP89/2134、ROC26、粤94/28、福农89/209、崖96/45等品种RSD发病率为0,表现为A级抗性;GT99/181、GT97/228、GT90/95等品种RSD发病率等于10%,表现为B级抗性;GT02/208、GT96/156、ROC22等品种表现为C级抗性;GT21、GT02/237、CP88/1762等品种表现为D级抗性。6个不同系列中,CP系列RSD平均发病率最低,为12.00%,抗性最强;粤糖系列RSD平均发病率最高,为28.57%,抗性较弱。【结论】GT02/351、CP89/2134、ROC26、粤94/28、福农89/209、崖96/45等甘蔗品种具有良好的抗性,具有推广应用价值;CP系列的抗性较强,可作为抗RSD的育种材料。