宿根矮化病菌诱导甘蔗差异表达基因的cDNA-SCoT分析

宿根矮化病是危害严重的世界性甘蔗主要病害之一，为了探究甘蔗在该病胁迫下的抗病分子机制，本研究以甘蔗品种新台糖22健康植株为材料，利用含有宿根矮化病病原菌的蔗汁诱导其抗性，分别在接种后2、4、6、8和10d取样，构建宿根矮化病侵染处理与对照的RNA混合池，利用cDNA-SCoT法进行差异显示研究。结果表明，80条SCoT引物扩增出500多条带，长度在100～1800bp之间。从中筛选出30个差异明显的条带，测序后序列拼接，获得22条高质量的EST序列。生物信息学分析显示，对甘蔗宿根矮化病的差异基因主要涉及能量代谢、防卫反应、信号转导、蛋白质类代谢等方面。进一步基因功能分析显示，油菜素内酯合成蛋白、NBS-LRR类抗性蛋白、茉莉酸诱导蛋白、α-微管蛋白、ABA胁迫成熟蛋白、富含脯氨酸蛋白、翻译起始因子eif-2b α亚族等可能参与了甘蔗宿根矮化病病原菌互作的过程。

甘蔗花叶病和宿根矮化病多重PCR检测方法的建立

【目的】建立能同时检测甘蔗花叶病(sugarcane mosaic virus,SCMV)和宿根矮化病(ratoon stunting disease,RSD)的多重PCR检测方法。【方法】以病株带鞘叶组织总核酸反转录物为模板,根据中国甘蔗花叶病的主要致病病原高梁花叶病毒SrMV和甘蔗花叶病毒中国大陆优势株系SCMV-A,结合B、D、E和SC株系的外壳蛋白核苷酸序列的保守区设计PCR引物对和已有的检测甘蔗宿根矮化病病原木质部赖氏杆菌木质部亚种(Leifsonia xyli subsp.Xyli,Lxx)的PCR引物对,在SCMV RT-PCR和RSD单一PCR体系的基础上,建立并优化可同时检测SCMV和RSD的多重PCR检测方法。【结果】此检测方法可特异地从感染SCMV和RSD的样品中扩增出SCMV(400 bp)和RSD(265 bp)2个条带,扩增产物测序结果表明,SCMV扩增产物与GenBank中其它株系或分离物的核苷酸序列同源性为81%～99%,RSD扩增产物与GenBank中其它株系或分离物的核苷酸序列同源性为91%～99%。【结论】应用此检测方法可稳定、特异地检测出蔗株中是否有导致甘蔗花叶病和宿根矮化病的单一或混合的病原。

甘蔗宿根矮化病PCR检测技术优化分析

【目的】在PCR的基本程序上,以甘蔗宿根矮化病菌Lxx16S～23S rDNA内部转录间隔区特异性引物,优化PCR反应条件,以建立稳定、快速、灵敏度高的甘蔗宿根矮化病PCR检测技术。【方法】以Lxx基因组DNA为模板,采用TaKaRa的Ex Taq Polymerase和2×GCBufferⅡ,调整退火温度和引物浓度等主要因子,优化PCR反应体系;稀释Lxx基因组DNA模板的浓度,检测优化PCR的灵敏度;用优化的PCR对田间生长的甘蔗品种GT11叶片总DNA进行RSD测定。【结果】优化的PCR得到清晰特异的条带为Lxx16S～23S rDNA内部转录间隔区序列;能从稀释1000倍的Lxx基因组DNA(15.9pg/μL)中检测到Lxx,而常规的PCR只能从稀释100倍的Lxx基因组DNA(159pg/μL)中检测到Lxx,且出现假阴性,不稳定。对田间生长的甘蔗品种GT11叶片总DNA进行PCR检测,结果用优化后的PCR检测RSD感染率为66.7%,而常规的PCR检测RSD感染率为0。【结论】优化的PCR体系为:2×GCBufferⅡ12.5μL,Ex Taq DNA酶(5U/μL)0.2μL;dNTP(2.5mmol/L)1.5μL;Lxx1(10μmol/L)1.0μL,Lxx2(10μmol/L)1.0μL,DNA模板1.0μL,用ddH2O双蒸水补足至25.0μL。PCR反应程序为:95℃预变性10min,94℃15s,57℃15s,72℃30s,40个循环;72℃延伸10min。优化的PCR比常规PCR的灵敏度高、结果稳定、检测效率高,更适合于田间大批量样品快速检测。

甘蔗宿根矮化病(RSD)温水脱菌研究

为寻求甘蔗宿根矮化病（RSD）的有效防控技术和方法，本研究根据甘蔗RSD的传播危害特点，选择五大主栽品种，采用温水处理设备对带菌蔗种进行温水（50±0．2℃）脱菌处理2h，分析研究温水处理对甘蔗RSD的脱菌效果。结果表明：温水（50±0．2℃）脱菌处理2h能有效去除甘蔗RSD，去除率为90％以上。与常规种苗相比，脱菌种苗在整个生长期中都表现出明显的生长优势，早生快发、伸长拔节早、长相健壮。粤糖93／159、ROC25号、ROC10号、闽糖69／421、桂糖17号5大主栽品种经温水脱菌处理均具有显著的增产增糖效果：新植增产甘蔗5．01～49．83t／hm^2，增幅5．97％-91．31％；甘蔗蔗糖分提高0．07％～0．86％（绝对值）。可见，种植温水脱菌种苗是防治甘蔗RSD最经济有效的措施，在生产上应加快推广，使之制度化，可大幅度提高甘蔗的产量和糖分，延长宿根年限，从而显著提高甘蔗生产的经济效益。

甘蔗宿根矮化病菌PCR检测及目的片段核苷酸序列分析

根据甘蔗宿根矮化病(RatoonStuntingDisease,RSD)病原细菌(Leifsoniaxylisubsp.xyli,Lxx)16S-23SrDNA基因间隔区核苷酸序列设计的一对特异性引物,建立了甘蔗宿根矮化病PCR检测方法;同时对PCR扩增的目的片段核苷酸序列进行测定与分析。结果表明广东湛江蔗区RSD病菌16S-23SrDNA基因间隔区核苷酸序列与巴西、澳大利亚及美国路易斯安娜州RSD株系基因组相应区段核苷酸同一率接近100%,病菌高度的同源。而与近缘的木质部赖氏杆菌狗牙根变种(Leifsoniaxylisubsp.Cynodontis,Lxc)和形态上相近的马铃薯环腐病菌(Clavibactermichiganensissubsp.Michiganensis)基因组相应区段核苷酸同一率较低,存在明显的分化。

广西主要蔗区甘蔗宿根矮化病调查

【目的】调查广西主要蔗区甘蔗宿根矮化病(Ratoon stuning disease,RSD)的发生情况,了解其分布、危害程度及发生规律,为推广甘蔗健康种苗,有效防控RSD提供科学依据。【方法】2013~2014年在广西9个糖料蔗主产区进行RSD发生情况调查和田间取样,采用PCR对采集的蔗茎样品进行RSD检测,并按不同蔗区、不同品种、不同植期、不同蔗地类型的发病率分析广西蔗区RSD发生状况。【结果】在278个样品中有198个样品检测出RSD,检出率为71.2%;调查的9个主产区均检测出RSD,阳性检出率在58.3%~100.0%;采集的27个甘蔗品种(系)均检测出RSD,其中主栽品种ROC22发病严重,RSD检出率达80.8%;新植蔗的RSD检出率为36.0%,宿根蔗的RSD检出率为75.7%,宿根年限越长,RSD检出率越高;旱地蔗的RSD发病率比水田高18.1%(绝对值)。【结论】RSD在广西普遍发生且发生严重,生产中急需推广甘蔗温水脱毒种苗和选育高抗且综合性状优良的甘蔗品种。

应用DB-EIA技术快速检测甘蔗宿根矮化病研究

就甘蔗宿根矮化病DB-EIA检测技术、检测灵敏度、样品蔗汁保存方式及保存时间进行研究。结果表明DB-EIA检测甘蔗宿根矮化病具有操作简单、高效、重复性好、灵敏度高、对蔗汁新鲜度要求不高等优点。该方法检测灵敏度为1～1/10(稀释倍数);蔗汁保存于4℃或-20℃条件下3d,对检测结果无显著影响,-20℃条件下保存45d,大部分样品检测结果不受影响,少部分样品出现假阴性。

宿根矮化病菌对甘蔗生长和内源激素的影响

甘蔗宿根矮化病(ratoon stunting disease,RSD)是由Leifsonia xyli subsp.xyli引起的病害。为研究该病对甘蔗的生长和内源激素的影响,选择2个甘蔗品种新台糖22号(ROC22)和果蔗(Badila),采用桶栽种植分别进行3个处理:感染RSD病菌蔗株进行52℃温汤脱菌处理30 min、感染RSD病菌蔗株、健康蔗株(对照),在出苗后90、120、150、180 d测定株高和内源激素的含量,并利用PCR检测确定感病和健康蔗株。结果表明:感染RSD病菌蔗株的株高显著低于对照和温汤脱菌处理;感染RSD病菌处理植株的赤霉素(GA3)、生长素(IAA)含量明显低于对照和温汤脱菌处理,而脱落酸(ABA)含量则相反,感染RSD病菌处理的ABA含量明显高于对照和温汤脱菌处理;对照和温汤脱菌处理的株高和激素含量差异不显著。

番禺果蔗宿根矮化病调查及分析

为明确广州市番禺果蔗主产区甘蔗宿根矮化病的发生情况,利用PCR技术,对随机采自番禺区农户和本所试验地120个果蔗样品进行检测。结果表明:黑皮果蔗的RSD检出率为93%,黄皮果蔗的RSD检出率为95%,果蔗健康种苗的RSD检出率为0%。果蔗健康种苗有效的去除了甘蔗宿根矮化病,推广果蔗健康种苗可促进果蔗产业健康发展。

云南双江蔗区甘蔗宿根矮化病的调查及病原检测

甘蔗宿根矮化病(Ratoon Stunting Disease,RSD)是一种世界性的重要甘蔗病害,对甘蔗生产危害极大。摸清蔗区RSD的分布、发生危害情况,是科学推广温水脱毒健康种苗,有效防控甘蔗宿根矮化病的关键。对云南双江蔗区甘蔗宿根矮化病的发生和分布进行了调查和田间采样,采用PCR和I-ELISA法,对田间采集的60个样本进行RSD检测。结果表明,51个样本为阳性,阳性检出率85%,9个样本为阴性,确认双江蔗区存在RSD;通过系统分析,明确了不同品种、不同植期、不同蔗地RSD发生状况,为双江蔗区推广应用温水脱毒健康种苗、有效防控甘蔗宿根矮化病提供科学依据。

甘蔗宿根矮化病研究进展

甘蔗宿根矮化病(Ratoon stunting disease,RSD)是由一种木质部限制性病原菌引起的病害,感染RSD的蔗株一般表现为植株矮化、分蘖少、生长缓慢,成熟蔗茎基部节位维管束组织一般呈粉红色至橙红色等变色症状。被染污的收割工具很容易将病菌传染给健康蔗株而使RSD迅速传播蔓延。酶免疫方法和PCR方法是检测RSD的常用方法,各有优缺点。用于RSD病原细菌培养的培养基有多种,使用最多的是SC培养基。选育抗RSD品种和健康种茎生产体系相结合是防治RSD最有效的措施。对RSD的基因分析已有一定进展,建议进一步利用基因组学和蛋白质组学分析方法进行研究。

甘蔗健康苗圃宿根矮化病检测及结果分析

甘蔗宿根矮化病(Ratoon Stunting Disease,RSD)是中国蔗区的一种主要甘蔗病害,影响甘蔗产量、蔗糖分及宿根蔗年限,也是导致甘蔗品种种性退化的重要原因之一,具有较严重的经济危害性。笔者应用实验室建立的甘蔗宿根矮化病菌PCR检测技术对1级或2级健康种苗圃种苗进行甘蔗宿根矮化病监测,以明确各级种苗圃宿根矮化病发生情况,为指导生产提供科学数据。检测结果为‘粤糖00-236’和ROC22新植1级和2级健康种苗圃均未检测出RSD,宿根1级健康种苗圃RSD检测率分别为20%和5%,各级健康种苗圃RSD总检出率分别为6.7%和2%,分别较其普通种茎苗RSD检出率降低86.6%和68%。结果表明,建立的甘蔗健康种苗圃已有效地去除了甘蔗RSD病菌。

热水处理防治甘蔗宿根矮化病的效果及对再生植株影响研究

甘蔗宿根矮化病(Ratoon Stunting Disease,RSD)在我国蔗区普遍发生,研究其防治方法十分必要。应用50℃2 h热水处理严重感染RSD的粤糖00-236,新台糖22号种茎,用斑点酶标记免疫试验(Dot blot en-zyme immunoassays,DB-EIA)检测RSD病原菌(Leifsonia xylisubsp.xyli,Lxx),研究热水处理脱菌效果;并以粤糖00-236热水处理种茎与未处理种茎进行田间对比试验,研究热水处理对种茎再生植株的影响。结果表明:50℃2 h热水处理种茎可极显著的杀死感病种茎中的RSD病原细菌Lxx,对RSD有较好的防效,但不能彻底去除感病种茎中的Lxx。与未经热水处理种茎再生植株相比,经热水处理的粤糖00-236感病种茎再生植株的茎长、节间长度、一茎重显著增加,有效茎数极显著增多,生长速度加快,蔗茎产量增加23.2%,但成熟期甘蔗品质几乎无差异。另外,热水处理对种茎蔗芽有损伤,降低了种茎萌芽率。结果表明:50℃2 h热水处理甘蔗种茎能有效的防治甘蔗RSD,促进甘蔗生长,具有显著的增产效应。

甘蔗叶片宿根矮化病的PCR检测

采用PCR方法对甘蔗植株不同生长时期(幼苗期、分蘖期、拔节期、成熟期)、同一植株的不同叶片及同一叶片的不同部位(叶尖、叶中、叶基)分别取样进行宿根矮化病检测。结果表明:在不同甘蔗生长时期常规PCR方法都可以检测出宿根矮化病阳性植株;对呈阳性植株的不同叶片及同一叶片的不同部位检测均呈阳性,说明被检测甘蔗品种植株不同位置叶片对甘蔗宿根矮化病检测效率影响差异不明显。

甘蔗种质资源抗宿根矮化病特性鉴定

【目的】筛选抗甘蔗宿根矮化病(RSD)种质资源材料,为选育抗RSD甘蔗品种提供优良抗原。【方法】采用浸蔗种的方法对6个系列100份甘蔗品种进行侵染,用建立的RSD-PCR检测方法进行检测,计算各甘蔗品种RSD发病率,并对甘蔗种质资源进行抗性评价。【结果】100份甘蔗品种材料中,GT02/351、CP89/2134、ROC26、粤94/28、福农89/209、崖96/45等品种RSD发病率为0,表现为A级抗性;GT99/181、GT97/228、GT90/95等品种RSD发病率等于10%,表现为B级抗性;GT02/208、GT96/156、ROC22等品种表现为C级抗性;GT21、GT02/237、CP88/1762等品种表现为D级抗性。6个不同系列中,CP系列RSD平均发病率最低,为12.00%,抗性最强;粤糖系列RSD平均发病率最高,为28.57%,抗性较弱。【结论】GT02/351、CP89/2134、ROC26、粤94/28、福农89/209、崖96/45等甘蔗品种具有良好的抗性,具有推广应用价值;CP系列的抗性较强,可作为抗RSD的育种材料。

湛江农垦蔗区甘蔗宿根矮化病调查研究

甘蔗宿根矮化病(Ratoon Stunting Disease,RSD)是一种世界性的重要甘蔗病害,对甘蔗生产为害较重。为了明确湛江农垦蔗区甘蔗RSD的发生情况,为健康种苗生产提供科学依据。本文应用斑点杂交酶链免疫法(DotBlotEnzymelinkedImmunoAssay,DB-EIA),对随机采于湛江农垦丰收、华海及广前三个主要蔗区的1935个蔗茎样品进行检测。结果表明,1935个样品中,RSD检出率为62.84%;广前公司蔗区、华海公司蔗区及丰收公司蔗区RSD发生率分别为95.3%、80.9%及41.0%;主要栽培品种新台糖22号、新台糖25号、粤糖89-113、粤糖79-177的RSD检出率分别为55.0%、54.2%、84.3%及94.8%;新植蔗发生率64.2%,宿根蔗发生率61.3%;调查的12个品种和84个甘蔗生产队均可检测出RSD。RSD在湛江农垦蔗区已普遍发生且发生率较高,主要栽培品种感病严重。

甘蔗宿根矮化病感病与非感病株根际土壤生物学性状及细菌群落结构特征

[目的]比较甘蔗宿根矮化病(ratoon stunting disease,RSD)感病植株与非感病植株根际土壤的生物学性状及细菌群落结构特征,旨在为构建甘蔗健康的根际微环境,筛选高效RSD生防细菌提供参考。[方法]通过田间调查和实验室鉴定,以甘蔗RSD感病植株为试材,非感病植株为对照,采集甘蔗RSD感病植株和非感病植株的根际土壤,并基于传统和现代高通量测序技术,分析了甘蔗RSD感病植株和非感病植株根际土壤的生物学性状和细菌群落结构特征。[结果]与甘蔗RSD非感病植株相比,感病植株根际土壤中指示土壤肥力与健康状况的生物学性状指标β-葡糖苷酶、磷酸酶和氨肽酶活性,以及微生物生物量碳、氮、磷显著降低;同时,指示细菌丰富度的Chao1指数和指示细菌多样性的Shannon指数显著下降。门分类水平与非感病甘蔗植株相比,RSD感病植株根际土壤中Proteobacteria(变形杆菌门)、Actinobacteria(放线菌门)、Gemmatimonadetes(芽单胞菌门)和Nitrospirae(硝化螺旋菌门)等优势门类细菌占比呈倍级降低,但Chloroflexi(绿弯菌门)、Acidobacteria(酸杆菌门)、Firmicutes(厚壁菌门)、Cyanobacteria(蓝细菌门)、Planctomycetes(浮霉菌门)、Bacteroidetes(拟杆菌门)等优势门类细菌占比呈倍级增加;在属分类水平,与非感病甘蔗植株相比,RSD感病植株根际土壤中Xanthobacteraceae(黄色杆菌属)、Acidothermus、Gaiellales、Roseiflexus(玫瑰菌属)、Micromonosporaceae(小单孢菌属)和Nitrospira(硝化螺旋菌属)细菌占比呈倍级降低,但Acidobacteria(嗜酸菌属)细菌及部分未知菌属却呈倍级提高。[结论]甘蔗RSD感病植株根际微环境中指示土壤肥力的生物学指标显著降低,细菌丰富度和多样性显著下降,部分优势细菌门属占比发生剧变可能是导致甘蔗RSD发生的重要原因。

柚矮化病调查和病原鉴定

柚矮化病调查和病原鉴定＊周常勇赵学源蒋元晖戴胜根唐科志杨方云黄森（中国农业科学院柑桔研究所重庆４００７１２）杨育龙李宗明王兆兰张高明谭晓张学武（四川省三台县农业局）（四川省达川市科委）（四川省南部县农业局８０年代以来，我国柚类生产发展较快，１９９５年...

宿根矮化病菌侵染后甘蔗防御酶活性变化

【目的】研究接种甘蔗宿根矮化病(Ratoonstuningdisease,RSD)菌后甘蔗防御酶活性的变化,为进一步探明甘蔗与RSD病菌的互作机制提供理论依据。【方法】以温汤脱毒后的甘蔗品种桂糖11号(GT11)为材料,设RSD菌液浸种为处理,ddH2O浸种为对照,测定甘蔗茎、叶不同时期超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)、过氧化氢酶(CAT)、抗坏血酸过氧化物酶(APX)、谷胱甘肽还原酶(GR)等5种防御酶活性变化。【结果】在RSD病菌胁迫下,甘蔗茎和叶片中相关防御酶活性均有所变化,茎中除APX活性一直高于对照外,其他酶活性均表现为在90d时低于对照,180d时高于对照;叶中除POD活性一直高于对照外,其他酶活性在90d时高于对照,180d时低于对照。【结论】在RSD病菌胁迫下,甘蔗茎和叶片中CAT、SOD、POD、APX及GR活性均有所提高,随着胁迫时间的延长在茎中出现逐渐高于对照的趋势,叶片则与此相反。

粤北翁源蔗区甘蔗宿根矮化病调查

为明确粤北翁源蔗区甘蔗宿根矮化病(Ratoon Stunting Disease,RSD)的发生状况,给甘蔗健康种苗生产提供科学依据,本研究通过斑点酶链免疫试验(DB-EIA),对随机采自翁源蔗区的232个蔗茎样品进行检测。结果表明:在232个蔗茎样品中,RSD检出率为28.4%;主要栽培品种新台糖22号、粤糖83-271、粤糖93-159、新台糖16号、粤糖85-177、黑皮果蔗的RSD检出率分别为3.2%、54.8%、54.2%、17.9%、50.0%和100.0%;坝仔、周陂、庙墩、龙仙等镇的甘蔗RSD发生较重,检出率分别为37.5%、36.4%、34.4%和30.4%;新植蔗的RSD检出率为35.6%,宿根蔗的RSD检出率为26.0%,田块的RSD检出率达73.5%,说明甘蔗宿根矮化病在翁源蔗区已普遍发生,且主栽品种感病严重。