NKX2-5基因63A>G突变对先天性心脏病相关基因表达的影响

目的探讨NK2同源异型框5(NKX2-5)基因63A>G突变对先天性心脏病相关基因表达的影响。方法构建绿色荧光蛋白(GFP)空载质粒、NKX2-5质粒和NKX2-563A>G质粒,将其分别转染至P19细胞,并分别设为GFP组、NKX2-5组和NKX2-563A>G组。通过荧光镜观察和检测GFP蛋白表达情况以评价转染效果。检测3组P19细胞转染后的细胞周期、细胞增殖情况,NKX2-5、GATA结合蛋白4(GATA4)、T盒转录因子5(TBX5)以及三者下游信号通路基因的mRNA表达水平。结果成功构建稳定转染细胞株。转染后,NKX2-5组的细胞增殖能力和S期细胞比例低于GFP组,而G_(1)期细胞比例高于GFP组;NKX2-563A>G组的细胞增殖能力和S期细胞比例高于NKX2-5组,而G 1期细胞比例低于NKX2-5组(均P<0.05)。3组P19细胞中NKX2-5、GATA4、TBX5的mRNA表达水平差异均无统计学意义(均P>0.05);但NKX2-5组骨形成发生蛋白4(BMP4)和心肌细胞增强因子2C(MEF2C)的mRNA表达水平高于GFP组,而NKX2-563A>G组BMP4和MEF2C的mRNA表达水平低于NKX2-5组(均P<0.05)。结论NKX2-5基因可抑制心肌细胞的增殖,而NKX2-5基因63A>G突变或可通过影响BMP4和MEF2C等基因的表达从而调控心肌细胞的细胞周期及增殖。

过表达SHOX2对BMP9诱导的小鼠间充质干细胞系C3H10T1/2成骨分化的影响

目的研究矮小身材同源框2(SHOX2)对骨形态发生蛋白9(BMP9)诱导的小鼠间充质干细胞系C3H10T1/2成骨分化的影响。方法构建SHOX2重组腺病毒(Ad-SHOX2),实验分为对照(NC)组、Ad-SHOX2组、BMP9组和BMP9+Ad-SHOX2组。碱性磷酸酶(ALP)评估早期成骨;钙盐沉积检测晚期成骨;显微镜观察细胞增殖;Western blot检测成骨相关转录因子(RUNX2)、增殖细胞核抗原(PCNA)、ERK1/2磷酸化及总蛋白表达。结果成功构建Ad-SHOX2。Ad-SHOX2组与BMP9组较NC组ALP活性、钙盐结节及RUNX2蛋白表达明显上升(P<0.05)。相较于以上两组,BMP9+Ad-SHOX2组ALP活性增高(P<0.05),低感染率BMP9+Ad-SHOX2组钙盐结节减少。高感染率组则较BMP9组钙盐沉积增多,与Ad-SHOX2组无明显差异。同时,BMP9+Ad-SHOX2组RUNX2蛋白表达高于BMP9组,低于Ad-SHOX2组(P<0.05)。显微镜观察Ad-SHOX2组与BMP9组细胞密度均高于NC组,PCNA蛋白表达上调(P<0.05)。且BMP9+Ad-SHOX2组PCNA蛋白表达高于BMP9组(P<0.05)。此外,Ad-SHOX2组及BMP9+Ad-SHOX2组较NC组T-ERK1/2和p-ERK1/2蛋白表达增高(P<0.05)。结论无外源性成骨刺激因子诱导条件下,SHOX2可能通过调控MAPK/ERK信号通路促进C3H10T1/2细胞增殖及成骨分化,但其与BMP9对成骨分化的调控作用是否可能互为拮抗,有待进一步研究。

MiR-375抑制的人诱导多能干细胞分化为起搏样细胞的研究

目的 探讨抑制miR-375表达能否使其修饰的人诱导多潜能干细胞(hiPSC)在向hiPSC源性心肌细胞(hiPSC-CMs)分化的过程中更高效地向起搏样细胞转化。方法 采用hiPSC时序性激活或抑制Wnt信号通路定向诱导分化到hiPSC-CMs,流式分析检测其分化效率。分别转染携带miR-375抑制剂和绿色荧光蛋白(GFP)的慢病毒rLV-ZsGreen-Puro-hsa-mir-375 inhibitor(miR-375组)和等量带GFP的空载慢病毒(GFP组),空白组不做转病毒处理(Null组)。分化14 d后在倒置显微镜下计算各组细胞每分钟搏动次数,采用实时荧光聚合酶链式反应和蛋白质免疫印迹检测三组起搏细胞发育相关转录因子(Shox2、Nkx2.5、Isl1)、起搏相关离子通道超极化激活环核苷酸门控通道4型(HCN4)mRNA和蛋白水平变化,采取免疫荧光法检测GFP组和miR-375组Shox2蛋白和心肌细胞特异性标志物心肌肌钙蛋白T(cTNT)的表达。结果 分化第7 d起可见细胞自发性搏动,流式分析结果cTNT阳性率超80%,hiPSCs成功诱导分化到hiPSC-CMs;与GFP组和Null组比较,miR-375组搏动速度及Shox2、HCN4、Isl1的mRNA和蛋白表达水平明显升高,Nkx2.5表达明显降低(P<0.05);荧光显微镜观察miR-375组Shox2蛋白表达强于GFP组,cTNT蛋白表达两组无显著差异。结论 通过抑制miR-375表达能增加hiPSCs向起搏样细胞的分化效率。