小麦黄矮病及其抗性育种研究进展

由大麦黄矮病毒(barley yellow dwarf viruses,BYDVs)侵染引起的小麦黄矮病(wheat yellow dwarf disease)是世界小麦上的主要病害之一,对小麦生产及粮食安全构成了严重威胁。本文综述了BYDVs的生物学特征、分类地位、致病机理及抗性育种等相关研究,并基于相关研究进展,提出了进一步扩大抗性基因挖掘、加快优异抗病基因克隆、加强抗病机理研究等方面的建议,旨在为我国小麦黄矮病抗性育种及科学防治提供一定的参考。

我国小麦黄矮病综合防治研究进展

小麦黄矮病为典型的小麦病毒病,对小麦的产量和生长发育有很大影响。为进一步研究小麦黄矮病的防治工作,文章结合国内外小麦黄矮病综合防治研究成果,综述了小麦黄矮病发生、防治等相关研究,并展望了小麦黄矮病未来研究方向,以期为小麦黄矮病有效防控提供参考。

小麦黄矮病抗性基因及其鉴定研究进展

小麦黄矮病是由大麦黄矮病毒(BYDV)引起的小麦主要病害之一。本文综述了小麦BYDV的主要抗性基因及其鉴定方法、微克隆和微分离的研究进展,并对其形态学标记、生化标记、细胞学分析和分子标记鉴定方法的原理及应用作了比较分析。本文最后还提出了目前研究中存在的问题及其未来研究的方向。

关于小麦黄矮病的研究进展

小麦黄矮病以晚熟冬麦和春麦区发生流行危害最重；新发生红穗症状；小麦品种抗病性持久，具有慢黄矮病性和发病的康复现象；介体禾谷缢蚜传播能力提高，赶上和超过了优势介体麦二岔蚜；发病与湿度关系密切；近年明显感染玉米和开始感染水稻。

抗黄矮病小麦新品系YW243的选育和细胞分子生物学鉴定

以小麦 -中间偃麦草二体异附加系 L1的衍生系 PP9- 1为黄矮病抗源 ,从 [( PP9- 1/陕 7859/ /丰抗 8号 ) F1× ( 3×丰抗 13号 / Khapli) F4 ]杂交组合 F2 代花药培养再生植株中选育出一个抗黄矮病小麦新品系 YW2 4 3。经黄矮病毒田间接种鉴定 ,细胞学分析 ,GISH和 RFL P分子标记检测 ,结果表明 :该系高抗黄矮病毒 GPV、 GAV株系 ,体细胞染色体数目为 2 n=4 2 ,花粉母细胞减数分裂中期 染色体构型为 2 n=2 1 ,遗传上稳定 ,是小麦 -中间偃麦草 7DS· 7DL- 7XL易位系 ,易位发生在 7DL的端部 ,携有一对来自中间偃麦草的 BYDV抗性基因。中国农科院植保所鉴定结果同时表明 :YW2 4 3兼抗小麦黄矮病、白粉病、条锈病、秆锈病和叶锈病等 5种病害 ,是一个优良多抗材料。

分子标记辅助选育兼抗白粉病、条锈病、黄矮病小麦新种质

选育和推广多抗、兼抗型小麦品种是今后小麦育种发展方向之一。本研究通过复合杂交、回交,将抗白粉病基因聚合体Pm4+Pm13+PmV、抗条锈病基因YrX(源自YW243)、抗黄矮病基因Bdv2向优异农艺亲本转育。利用抗病性鉴定和分子标记辅助选择,选育出聚合了3～5个抗病基因的兼抗白粉、条锈和黄矮病的冬性小麦新种质和春性小麦新种质,其中聚合Pm4+Pm13+PmV+YrX+Bdv2等5个抗病基因的冬性材料1株,聚合Pm4+Pm13+YrX+Bdv2d的冬性、春性(BC2F3)材料分别为2株、3株,聚合Pm4+PmV+YrX+Bdv2等4个抗病基因的冬性、春性(BC2F3)材料分别为6株和18株,聚合Pm13+YrX+Bdv2、PmV+YrX+Bdv2等3个抗病基因的春性材料分别为7株和46株。本研究可为小麦多抗、兼抗育种提供遗传组成明确的丰富抗源和快捷的选择方法。

小麦蓝矮病植原体16S rDNA基因片段的比较分析

小麦蓝矮病是陕西乃至西北冬麦麦区的一个重要病害,由介体条沙叶蝉专化性传播.对小麦蓝矮病株叶片和带毒条沙叶蝉进行超薄切片及电镜观察,在叶片韧皮部和叶蝉后肠中均观察到大量典型植原体.利用植原体16S rDNA基因保守序列通用引物对Rm16F2/Rm16R1,应用PCR技术从小麦蓝矮病株叶片中扩增到1.4kb的特异片段.通过对16S rDNA基因片段序列同源性比较,结果表明小麦蓝矮病病原与三叶草绿变、翠菊黄化、绣球花绿变、草莓矮化和番茄巨芽植原体亲缘关系较近,其同源率为99.2%～99.9%.据此可以判定小麦蓝矮病植原体是属于植原体16SrⅠ组,确定了其分类地位.

源于L1的小麦抗黄矮病基因的特异PCR标记及辅助育种的研究

以小麦 -中间偃麦草附加系 L1为抗源 ,选育出抗黄矮病小麦异源易位系 HW6 4 2 ,YW4 4 3,YW2 4 3,Y9910 2 9等。本文以上述易位系及其抗源、小麦亲本作供试材料 ,鉴定出一个微卫星 (Simple sequence repeat,SSR)标记gwm37- 450 ,可跟踪、检测源于 L1的抗黄矮病基因。将难以分辨、稳定性差的 gwm37- 450 特异带分离、克隆、测序 ,根据测序结果重新设计 1对特异 PCR引物 ,转化为扩增产物有无的 SCAR(sequence characterizied amplified region)标记SC- W374 50 。利用 HW6 4 2 /中 86 0 1的 F2 群体 ,对 gwm 37- 450 和 SC- W374 50 进行分析 ,结果表明 ,二者均与抗黄矮病基因紧密连锁 ,后者较前者稳定。利用 SC- W374 50 跟踪抗黄矮病基因 ,将抗黄矮病基因、抗白粉病基因向优良小麦品种中麦 16、宛 710 7转育 ,快速选育出兼抗黄矮病、白粉病的回交植株 2 7个。实践了分子标记辅助抗黄矮病小麦育种的技术路线。

小麦兰矮病病原物——类菌原体的初报

对陕西、甘肃历史上严重发生的小麦兰矮病经超薄切片电镜观察,在受侵叶切片韧皮部筛管细胞、叶肉薄壁细胞及叶绿体中可见大量典型类菌原体病原物。根据症状特征和类菌原体病原物,初步定名为小麦类菌原体兰矮病(Wheat Mycoplasma Like-Organism Blue Dwarf-WMBD)。

几种药剂对小麦黄矮病的防治效果

为明确病毒抑制剂对小麦黄矮病的预防和防治效果,在小麦起身期将大麦黄矮病毒GAV株系接种于小麦陕恳9740上,喷施杀虫剂(2.5%吡虫啉可湿性粉剂2000倍液)与病毒抑制剂(20%病毒A可湿性粉剂500倍液、3.95%病毒必克可湿性粉剂500倍液、5%菌毒清水剂500倍液和2%菌克毒克水剂300倍液)的不同组合,于小麦开花期统计发病率、病情指数和小麦叶片黄化率,结果表明,各组合均能早期预防和防治小麦黄矮病发生和发展,且预防效果优于防治效果,其中病毒必克与吡虫啉组合的平均预防和防治效果最显著,分别为58.08%和53.03%。进一步利用病毒必克在室内进行防治性试验,发现病毒必克能够抑制GAV对叶绿素的破坏,可减轻大麦黄矮病毒对小麦的危害。

应用原位杂交及RAPD技术标记抗黄矮病小麦一中间偃麦草染色体异附加系

以生物素（Ｂｉｏｔｉｎ－１６－ｄＵＴＰ）标记中间偃麦草基因组 ＤＮＡ为探针，与抗黄矮病小麦－中间偃麦草染色体异附加系Ｚ６进行原位杂交，鉴定出附加的１对中间偃麦草染色体。对异附加系 Ｚ６和 Ｌ１及它们的小麦亲本进行了 ＲＡＰＤ分析，从 １２０个随机引物中，筛选出 ２个引物可以扩增出附加染色体的特异ＤＮＡ片段，可作为鉴定寻人小麦的中间偃麦草染色质的分子标记。

小麦蓝矮病植原体延伸因子(EF-Tu)tuf基因序列的同源性分析

目的利用分子生物学方法分析小麦蓝矮病植原体延伸因子tuf基因,从亚组水平上确定小麦蓝矮病植原体的分类地位。方法电镜观察自然发病的小麦蓝矮病病叶;用引物fTufu/rTufu对小麦蓝矮病植原体延伸因子tuf基因进行PCR扩增;核苷酸序列测定及分析。结果经电镜超微结构观察,在韧皮部观察到大量典型植原体。通过PCR扩增得到约850bp的特异片段。感受态转化后,进行测序,结果表明小麦蓝矮病植原体tuf基因片段长842bp,编码280个氨基酸。分析比较15种植原体延伸因子tuf基因的同源性,结果表明小麦蓝矮病植原体与三叶草绿变(KVF)亲缘关系最近,核苷酸同源性为99.9%,氨基酸同源性为100%。结论从亚组水平上确定了小麦蓝矮病植原体的分类地位,为研究小麦蓝矮病植原体的来源及致病分子机理提供理论依据。

携带抗黄矮病基因染色体的分离

抗黄矮病小麦-中间偃麦草异附加系Z_2(2n=44)携带一对完整的中间偃麦草染色体,用Z_2作母本与普通小麦品种中8601杂交,获得杂种F_1(2n=43=21Ⅱ+1Ⅰ).利用激光显微切割技术将F_1花粉母细胞减数分裂中期I及后期I的呈单价体的中间偃麦草染色体分离出来,经去蛋白、Sau3AI酶切后,进行PCR体外扩增.结果表明利用激光显微切割可分离导入小麦的外源染色体,为进一步建立单条染色体的基因文库并从中筛选与抗黄矮病基因紧密连锁的分子标记提供了一种简便的方法.

利用BSMV-VIGS技术快速分析小麦TNBL1基因的抗黄矮病功能

小麦黄矮病是由蚜虫介导的大麦黄矮病毒(Barley yellow dwarfvirus,BYDV)侵染引起的小麦重要病害之一。利用cDNA-AFLP分析,筛选出在抗黄矮病小麦易位系YW642中特异表达的长度为292bp的cDNA片段,以此片段为启始序列,利用RACE和RT-PCR技术克隆出该基因的全长cDNA序列,推导该基因编码1个NBS-LRR蛋白,将其命名为TNBL1。本研究利用大麦条纹花叶病毒(BSMV)诱导的基因沉默(virus-inducing gene silencing,VIGS)技术,快速分析TNBL1是否参与小麦抗黄矮病反应。通过PCR添加酶切位点、定向酶切与连接,将TNBL1特异的292bp片段反向整合到BSMV-γ链的多克隆位点上,获得重组载体BSMV-γ:TNBL1as,体外转录BSMV-VIGS载体的3个组分(BSMV-TNBL1as、BSMV-α和BSMV-β),等量混合、摩擦接种到抗黄矮病的小麦易位系YW642幼苗叶片上,使YW642中TNBL1基因沉默,然后接种BYDV病原进行黄矮病抗性鉴定。结果表明,TNBL1基因沉默后的YW642对BYDV敏感、显现感病症状,其体内BYDV含量较未发生基因沉默的YW642中的明显增加,证明TNBL1基因是正向调控小麦抗BYDV反应的1个重要基因。

抗黄矮病小麦种质的分子标记

应用基因组原位杂交技术分析了抗小麦黄矮病种质的遗传组成,研究表明小麦-中间偃麦草部分双二倍体无芒中4（2n=56）具有40条小麦染色体、5对中间偃麦草染色体、3对小麦/中间偃麦草易位染色体,其中1对是罗伯逊氏易位染色体。结果表明无芒中4与远中5的遗传组成有明显差异,是两种不同类型的材料。抗黄矮病小麦种质F940418、T103均为抗病易位系,易位片段位于小麦染色体的端部,且为小片段易位。应用RAPD技术筛选出与来自L_1（抗黄矮病异附加系的抗黄矮病基因连锁的分子标记AB-01_(1500),为抗黄矮病育种提供了可靠的选择标记。

抗黄矮病小麦新品系YW443的分子细胞遗传学鉴定

以小麦－中间偃麦草二体附加系L1衍生抗病系PP9－1为抗源，与小麦推广品种陕7859、丰抗8号杂交并自交，在F6代中选到农艺性状优良的高抗黄矮病小麦新品系YW43。对YW443及其亲本进行抗病性鉴定。结果表明：YW443高抗大麦黄矮病毒GPV、GAV株系。利用基因组原位杂交、RFLP分析和RAPD分析，研究YW43的遗传构成及其抗病基因染色体归属。结果表明：YW443（2n＝42）的遗传构成为40条（20对）小麦染色体和2条（1对）小麦－中间偃麦草易位染色体，易位的中间偃麦草染色体片段较小，属于St基因组，小麦染色体7D长臂末端片段被中间偃麦草染色体7St长臂末端片段取代，小麦新品系YW443为小麦－中间偃麦草7DS·7DL－7StL易位系，其抗病基因位于7StL末端。筛选出的特异RAPD标记OPR19-900，能检测出L1及其衍生抗病系的中间偃麦草染色体7StL片段，可作为鉴定抗黄矮病易位系的1个标记。

水稻草矮病特异蛋白抗血清的制备及应用

采用不同ｐＨ 值沉淀法及超速离心获得提纯的水稻草矮病特异蛋白。提纯的Ｓ－ 蛋白具有典型的蛋白紫外吸收曲线，提纯产量为２８ ｍｇ／１００ ｇ 病叶。从ＳＤＳ－ ＰＡＧＥ 精提纯的Ｓ－ 蛋白免疫兔子上获得抗血清，经微量沉淀反应、琼脂双扩散测定，其效价分别为１∶１０２４ 和１∶２５６ 。获得的Ｓ－ 蛋白抗血清与提纯的Ｓ－ 蛋白及感病植株，在琼脂双扩散反应中，均有明显的沉淀线出现，对照健株及提纯的水稻草矮病毒则无反应。利用制备的Ｓ－ 蛋白抗血清经Ａ－ 蛋白酶联免疫吸附法检测，结果表明：Ｓ－蛋白抗血清与提纯Ｓ－ 蛋白及感病植株有专化性反应，且不同品种、不同部位、接种后不同发病时间的水稻病株中Ｓ－ 蛋白的积累量有差异，这就为ＲＧＳＶ 的检测提供了一种快速。

利用中间偃麦草抗病基因同源序列分离黄矮病抗性候选基因克隆

根据已克隆植物抗病 (R)基因编码蛋白质的保守结构设计简并引物 ,利用同源序列法PCR扩增、克隆到 9个具有开放阅读框的中间偃麦草R基因同源片段 (ResistanceGeneAnalogs ,RGAs)。利用抗黄矮病材料 (含Bdv2 )、感黄矮病材料 (无Bdv2 )进行RFLP分析 ,筛选到 1个NBS类RGA序列TirgaZ1与Bdv2连锁。根据TirgaZ1的序列重新设计 1对引物 ,优化PCR扩增条件 ,将其转化为经典特异PCR标记 (SC TZ1)。利用该特异PCR标记 (SC TZ1)和克隆池 PCR法筛选抗黄矮病小麦 中间偃草易位系HW6 4 2基因组的可转化人工染色体 (Transformation competentArtificialChromosome ,TAC)文库 ,分离到 4个阳性TAC克隆T1～T4。限制酶切图谱分析结果表明 ,T1～T3为 1类 ,插入片段约 2 3kb ,T4为另 1类 ,插入片段约为 2 5kb。以TirgaZ1为探针 ,通过Southern杂交证实了阳性TAC克隆T1、T4为含有TirgaZ1序列的抗病基因候选克隆。分别以中间偃麦草、HW6 4 2和小麦亲本为探针对阳性克隆T1、T4进行Southern分析 ,结果表明 ,阳性TAC克隆T1、T4的插入片段均具有抗黄矮病易位系的中间偃麦草易位染色体片段 7XL ,T1、T4为抗黄矮病基因候选克隆。测定和分析阳性克隆T1插入片段 5 '端 - 6 4 4 8bp部分的序列 ,表明其最长完整开放阅读框

利用生物化学标记分析鉴定一个抗小麦黄矮病的小麦新种质

利用多个生化标记系统对一个抗小麦黄矮病新种质（ＨＧ２９５）进行了分析鉴定。胚乳水溶蛋白等电聚焦表明，在ｐＨ８．０－１０．２范围内，中５有３条在其小麦亲本南大２４１９、克强中均不存在的特异带，其中只有第２条在ＨＧ２９５中得到表达。在ＨＧ２９５中，２ＤＳ控制的那条水溶蛋白带发生了缺失。ＨＧ２９５中２ＤＳ的缺失在Ｐｅｒ－５与Ｅｓｔ－６电泳分析中进一步得到确证。Ｅｓｔ－７酶谱表明，中５与ＨＧ２９５均表达１条来源于中间偃麦草［Ｔｈｉｎｏｐｙｒｕｍｉｎｔｅｒｍｅｄｉｕｍ（Ｈｏｓｔ）ＢａｒｋｗｏｒｔｈａｎｄＤｅｗｅｙｏｒＡｇｒｏｐｙｒｕｍｉｎｔｅｒｍｅｄｉｕｍ（Ｈｏｓｔ）Ｂｅａｕｖ］的特异带，在ＨＧ２９５中可能发生２ＤＬ的缺失。过氧化物的歧化酶分析表明，在ＨＧ２９５中确实发生了２ＤＬ的缺失，并且与中５一样表达１条可能来源于中间偃麦草的特异带。各种结果都表明ＨＧ２９５是一个２Ｅ（Ｘ）／２Ｄ双体异代换系。

小麦黄矮病新抗源中4、中5的选育及应用研究

中4、中5是用经过连续3年系统选育的天蓝偃麦草作父本,地理远缘的小麦品种克强与南大2419杂交的F_5后代材料作母本,通过两者杂交,并采取延长生育法等技术克服F_1不育性,经过连续9年选育而成.对小麦黄矮病高抗,对条、叶、秆三种锈病的多种生理小种均表现免疫至高抗,还具有高蛋白(含量17.08%、17.13%);高赖氨酸(含量为0.483%、0.50%)等特点,是人工合成的优异的小麦多抗、优质资源.用中4、中5与普通小麦杂交,已成功地将抗黄矮病基因转移到普通小麦,育成陕麦8007、陕麦8124、忻4070、忻4079、中1001等品种(系).