pTYB11载体的应用及其重组子破菌条件的研究

IMPACTTM—CN蛋白质纯化系统的pTYB11载体的应用,有利于快速分离靶蛋白。因靶蛋白位于胞内,需采取有效破碎手段获取。采用超声波破碎,试验找出重组大肠杆菌的最佳破碎条件为:超声时间占空比为3:7,输出功率40W,破碎0.5h。western-blotting检验可以得到抗原性正常的靶蛋白。

高效破乳菌的破乳效能及活性成分

采用Tween60、Span60和航空煤油制备稳定的O／W型乳状液作为模型乳状液，将从大庆油田受石油污染土壤中分离到的一株芽孢杆菌属莫海威芽孢杆菌（Bacillus mojavensis）XH-1制成XH-1菌全培养液用于该模型乳状液的破乳，考察培养条件和破乳实验条件对XH-1菌破乳性能的影响。结果表明，与目前现场常用化学破乳剂相比，XH-1菌全培养液具有优良的破乳性能，其对O/W型乳状液破乳24h的破乳率可达85％以上。XH-1菌具有较强的传代稳定性；其最佳培养及破乳条件：以葡萄糖和液体石蜡的混合物为碳源、pH值6．5、摇床转数140～160r／min。XH-1菌的破乳活性成分耐低温不耐高温，超声波破碎处理对其破乳活性影响不大，经胃蛋白酶、胰蛋白酶及尿素处理后其基本失活。显微观察及实验分析表明，XH-1菌主要破乳活性成分为胞外分泌的蛋白物质。

剩余污泥超声提取液培养生物破乳菌Alcaligenes sp.S-XJ-1

将超声法预处理剩余污泥得到的提取液用于培养高效生物破乳菌Alcaligenes p．S—XJ-1，以探索剩余污泥资源化利用的新途静．使用超声能量（氐）为443～56647k-T／kgTS的超声条件处理剩余污泥，获得的污泥提取液中氨氮、有机氮、总磷的浓度最高分别为171．94，142．20，76．29mg／L，提取液中包含K、Ca、Mg、Fe等破乳菌生长必须的金属元素．将污泥提取液（Es为885～56647kJ／kgTS）作为培养基周于合成高效破乳菌Alcaligenessp．S-XJ1，产量较MMSM培养基可提高0．3％~68．3％，其中B为56647kJ／kgTS时破乳菌产量最高，为2．03g／L．污泥提取液中的pH缓冲能力对菌体产量有重要影响，提取液的有机氮浓度可能是破乳蒲产量提高的关键因素．污泥提取液培养的破乳荫破乳性能稳定保持在80．0％左右，菌体细胞表面疏水性与菌体C／N较MMSM培养基培养菌体无明硅差异．说明以剩余污泥超声提取液作为培养基可以培养稳定高效的破乳菌Alcaligenesso．S-XJ-1．

破乳菌种TR-1的筛选与破乳性能实验研究

从克拉玛依受石油污染的土壤中筛选出一株原油破乳菌TR-1。介绍了筛选方法。筛选时使用含水原油静置分层产生的油、水相等体积混合制备的W／O乳状液．35℃、50天自发脱水率〈5％；细菌全培养液加量为100mL/L。培养温度35℃，最佳培养pH值7～9．时间5～6天。所得培养液含菌1．1×100个／mL．含干菌体～8．68g／L，35℃、150min脱水率〉90％；2.0g／L干菌体水悬液相同加量时脱水率为80．0％；现用聚醚破乳剂加量100mg／L时脱水率～55％。TR-1菌主要以菌细胞破乳，所产生物表面活性剂也起一定破乳作用。TR-1菌破乳性能稳定，第1、5、25代全培养液的脱水率分别为88．3％、91．7％、80．0％。2．0g／L干菌体水悬液用于克拉玛依采油一厂、二厂含水50．0％、66．7％的稀油破乳（50℃），加量100mL／L时脱水率为66．7％、88．2％．高于现用聚醚破乳剂的脱水率，但对二、三区混合稠油无破乳效果。50℃、150min自发脱水率为16．5％的含水50．0％的稀油，加入5、20、40mg／L聚合物PAM后自发脱水率变为2．0％、4．0％、43．9％，再加入100mL／L干菌体水悬液时脱水率分别为96．5％、80．5％、76．5％．均高于加入100mg／L。化学破乳剂时的相应值。图3表4参6。

一株芽孢杆菌破乳特性试验

为准确、高效地调控生物破乳菌对破乳活性物质的生产,采用自筛破乳菌Bacillus mojavensis sp.,以O/W型模型乳状液作为破乳对象,分别测定在不同培养时间,全培养液不同组分,以及不同碳、氮源的条件下对该菌破乳效能的影响情况.结果表明:培养时间在14～24h全培养液的破乳活性最高.全培养液和中层液破乳效能高,菌体不具备破乳能力.烃类碳源可诱发该破乳菌产生具有破乳活性的代谢产物,而碳水化合物可以促进破乳菌的生长,其中果糖+液体石蜡组成的混合碳源对破乳菌的生长和破乳效能最有利.混合氮源NH4NO3+酵母膏更适于该破乳菌的生长及破乳活性物质的产生.控制培养时间和碳源、氮源的种类,可有效调控该破乳菌代谢产物破乳活性的高低.

生物破乳剂产生菌LH-1破乳条件优化分析

以石油污染土壤中筛选到的一株破乳菌LH-1为研究对象,鉴定其生理生化指标鉴定,探究培养条件对破乳菌LH-1破乳效能影响,确定破乳菌LH-1最佳培养条件:初始p H 7,培养温度33℃,菲浓度75mg·L^(-1),发酵液接种量4%,培养时间为5 d。此条件下破乳菌LH-1的24 h破乳率为95.67%,说明该菌是一株高效破乳菌。经理化分析,确定LH-1产生的生物破乳剂有效成分存在于细胞外,游离于培养液中,而菌体自身不具破乳能力。采用醇提方法得到破乳粗产物,经温度、酶解后验证破乳效果,结果显示,LH-1所产破乳剂为脂肽类物质。

生物破乳剂产生菌筛选及其效能检测方法的评价

针对目前生物破乳剂产生菌筛选方法和评价手段单一、操作复杂的问题,选用22株破乳菌(由本实验室筛选),测试血平板法、蓝色凝胶平板法、油平板法、液滴坍塌试验、排油圈法及表面张力法这6种方法检测菌株破乳能力的准确度.结果表明:前3种方法能快速判断菌源样品中潜在破乳菌的存在.其中血平板法更适用于初筛含油土壤中的破乳菌,识别率为92.9%;蓝色凝胶平板法可用于活性污泥中破乳菌的初筛;而77.3%的破乳菌可被油平板法识别.后3种方法可定量评价破乳能力.其中排油圈法评价准确度为95.5%;表面张力法评价准确度为86.4%;液滴坍塌试验仅适用于筛选自含油土壤的破乳菌,评价准确度为71.4%.

生物破乳剂产生菌的筛选及破乳效能研究

建立一套高效的生物破乳剂产生菌筛选方法是解决破乳剂产生菌筛选困难的主要途径,利用这种方法从大庆油田采油废水中分离、筛选得到1株对水包油型(O/W)和油包水型(W/O)两种乳状液均具有破乳效能的高效生物破乳剂产生菌,该菌对这两种乳状液在20 h的破乳率均可达90%以上。生理生化鉴定及基于16S rDNA基因序列的系统发育分析表明,该菌属于芽孢杆菌属(Bacillus),菌株编号LH1。实验发现,LH1菌的有效破乳成分为胞外代谢物质,低温、高温及超声破碎处理均对其破乳活性无明显影响,说明破乳菌LH1具有良好的应用价值。

含油土壤中生物破乳菌的分离纯化及筛选

以大庆油田长期受石油污染的土壤为生物破乳菌筛选来源,经菌种的定向培养及分离纯化得到了菌种的单菌落,配置含水40%稳定时间大于100h的W/O型模拟乳状液,对含油土壤培养法培养得到的9种菌进行模拟乳状液破乳实验,筛选得到了破乳率大于85%的两种生物破乳菌。

生物破乳菌XH-1的破乳有效成分研究

对破乳菌XH-1(Bacillus mojavensis)的破乳效能进行研究,并对该菌所产生的破乳剂有效成分及其理化性质进行考察。结果表明,破乳菌XH-1全培养液针对O/W型模型乳状液24h破乳率为86.0%,48h破乳率可达100%;XH-1菌的破乳有效成分为胞外分泌物质,该物质耐低温、不耐高温、经胃蛋白酶、胰蛋白酶及尿素处理后其基本失活;采用不同蛋白质粗体方法对破乳活性物质进行处理,发现粗提产物均具有较好的破乳功能,说明该物质具有蛋白质的特性;经可见-紫外分光光度法扫描及红外光谱扫描分析发现该生物破乳剂的有效成分为破乳菌株XH-1发酵产生的胞外蛋白类物质。

生物破乳剂产生菌XH-1的发酵动力学

为了优化生物破乳剂生产的发酵过程,提高生物破乳剂的产量,对破乳剂产生菌Bacillus mojavensis XH-1的分批发酵过程进行了研究.根据破乳剂产生菌XH-1发酵过程的特点,在Logistic方程和Luedeking-Piret方程的基础上,建立了菌株XH-1发酵过程中菌体生长、基质消耗和蛋白类破乳剂形成的动力学方程.采用Origin 7.5软件对试验数据进行处理,得到了破乳菌XH-1的分批发酵动力学模型参数.结果表明:模型预测值和试验值吻合较好,所建立的方程能较好地预测其实际发酵过程,具有很好的适用性,对生物破乳剂的发酵生产具有一定的指导意义.

基于环介导恒温扩增法快速检测破伤风梭菌

目的利用环介导恒温扩增技术,设计快速检测破伤风梭菌的方法,以便对破伤风梭菌感染进行快速检测。方法 (1)设计针对破伤风梭菌的环介导恒温扩增检测方法。(2)对破伤风梭菌恒温扩增法进行特异性试验。(3)对破伤风梭菌恒温扩增法进行灵敏度试验。结果 (1)设计出针对破伤风梭菌的恒温扩增检测方法。(2)本恒温扩增检测方法只扩增破伤风梭菌DNA,对其他菌不扩增,显示出良好的特异性。(3)本恒温扩增检测方法的最低检测限为1×101 CFU/25μL,灵敏度高。结论本试验设计的破伤风梭菌恒温扩增检测方法具有较高的灵敏度和特异性,简便、快速,适用于破伤风梭菌现场检验。

生物破乳菌Alcaligenes sp. S-XJ-1氮源利用特性

以六种氨基酸及硝酸铵为氮源培养胞壁结合型生物破乳剂产生菌Alcaligenes sp.S-XJ-1,进而分析菌体对谷氨酸和硝酸铵的利用过程,并建立菌体的生长及氮源利用模型.结果表明:氮源种类和投量是影响菌体产量和性能的重要因素;菌体对氮源的利用顺序依次为有机氮、氨态氮、硝态氮;谷氨酸为氮源时对生物破乳菌产量的促进效果最佳,相比于硝酸铵为氮源时,菌体最大比增长速率和产率系数更高,用于菌体代谢供能的氮源消耗量更低.

生物破乳菌的培养及代谢产物分析

从胜利油田采出水及其它样品中筛选得到破乳效果较好的D3破乳菌，考察了该破乳菌的培养条件及代谢产物。结果表明，D3菌的适宜生长条件为：温度40℃，pH7～9，培养时间72h。D3菌为革兰氏阴性细菌，归为沙雷氏菌属；其代谢产物主要含有：鼠李糖酯、脂肽类、醛、胺。D3菌质量浓度10g／L时，油水的界面张力由7.65mN／m降至0．98mN／m；当菌浓度在0．5～1．0g/L时，含油污水的除油率大于50％。

W/O型乳化液生物破乳菌的筛选及性能研究

从菌种采集开始,经富集和定向培养,得到可用于W/O型乳化液破乳的优势菌株,并对其破乳性能及影响破乳性能的主要因素进行了研究。试验结果表明,在破乳时间24h内,生物破乳菌的破乳效率可达约90%。菌龄、碳源、破乳时间、破乳温度等对破乳性能产生影响,而灭菌处理对破乳性能无明显影响。

丙酮在细菌ArgRS纯化过程中的作用

目的：纯化细菌的精氨酸－ｔＲＮＡ合成酶。方法：培养大肠杆菌、酵母菌、嗜热脂肪芽胞杆菌，分别采用超声波破菌和丙酮破菌、层析、测活力峰。结果：酵母菌、大肠杆菌用不同和破菌方法纯化结果完全相同，丙酮破菌法显著提高嗜热脂肪芽胞杆菌ＡｒｇＲＳ的纯化。结论：丙酮在破菌过程中去掉了嗜热脂肪芽胞杆菌体内的大量脂类化合物，提高了纯化效率。

绿色生物破乳技术原理及研究状况

介绍了生物破乳剂的作用机理、破乳模型以及生物破乳剂研究的主要状况,在此基础上,对生物破乳剂的研究前景进行了展望。

饲料中添加产油红酵母菌株PR61干菌体对红鲫鱼生长性能及体色的影响

试验旨在研究产油红酵母菌株PR61干菌体作为鱼类饲料添加剂的剂量以及破壁处理对红鲫鱼饲喂效果的影响。选用平均体重4~5 g的红鲫鱼375条,随机分为5组,每组3个重复,每个重复25条鱼。空白对照组鱼饲喂100%基础饲料,阳性对照组鱼饲喂100%基础饲料+0.25%甜菜碱盐酸盐,T1组鱼饲喂99.5%基础饲料+0.5%未破壁红酵母,T2组鱼饲喂99.5%基础饲料+0.5%破壁红酵母,T3组鱼饲喂99%基础饲料+1%破壁红酵母。试验期28 d。结果显示,产油红酵母菌株PR61干菌体营养丰富,蛋白质含量高达45.2%,油脂含量高达38.93%,还含有类胡萝卜素及天门冬氨酸、丝氨酸等17种氨基酸,氨基酸总量为44.32%。T2组和T3组红鲫鱼成活率为100%,显著高于空白对照组和阳性对照组(P<0.05);T3组红鲫鱼的增重率显著高于其他组(P<0.05),体长增长率显著高于空白对照组、阳性对照组和T1组(P<0.05),饲料系数显著低于其他组(P<0.05)。T3组红鲫鱼背部皮肤的红度(a*值)、亮度(L*值)显著高于其他试验组(P<0.05)。T2组和T3组红鲫鱼血清中超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性显著高于其他组(P<0.05),丙二醛(MDA)含量显著低于其他组(P<0.05)。T3组红鲫鱼血清中过氧化氢酶(CAT)活性显著高于空白对照组、阳性对照组和T1组(P<0.05)。研究表明,饲料中添加破壁红酵母PR61干菌体能够显著提高红鲫鱼的成活率、增重率和抗氧化酶活性,降低饲料系数;破壁红酵母添加量为1.0%时,红鲫鱼的生长指标达最佳水平,鱼体颜色更鲜艳。

非融合型重组人白细胞介素-18的纯化及鉴定

目的 获得高纯度的重组人白细胞介素 18(rhIL 18)。方法 采用溶菌酶加超声破菌的方法抽提包涵体 ,以8mol/L尿素溶解包涵体 ,变性条件下以阴离子柱层析进行首步纯化 ,复性后再进行凝胶过滤层析。对纯化的样品进行了SDS PAGE、HPLC、N端氨基酸序列、免疫印迹及生物学活性分析。结果 rhIL 18在大肠杆菌中以不溶性包涵体形式存在 ,所提取的包涵体中重组蛋白纯度可达到 80 %以上 ,包涵体经二步柱层析纯化后 ,HPLC分析纯度达 98%以上 ,SDS PAGE测定其分子质量约 19× 10 3 ,N端 15个氨基酸序列与预期一致 ,生物学活性分析证实纯化的rhIL 18具有诱导人外周血单个核细胞 (PBMC)产生IFN γ的能力。结论 所建立的纯化rhIL 18的方法简便有效 ,为开展rhIL 18的结构活性关系研究及其大规模纯化打下了良好的基础。

生物破乳菌的筛选及发酵条件的优化

生物破乳剂的开发可以降低油田乳状液对石油工业和生态环境的负面影响并减少化学破乳剂的使用量。本研究建立了一套高效、便捷的破乳菌筛选方法,并对破乳菌的发酵条件进行研究。利用大庆油田受石油污染土壤作为菌种来源,将Tween60-water(0.072%,V/V)和Span60-oil(0.028%,V/V)以6.5:3.5体积比配置出可以稳定200h以上的O/W型乳状液,用于破乳菌破乳效能的评价。经过分离纯化、血平板试验、排油试验和破乳试验最终筛选出2株24h平均排油率在80%以上的优势破乳菌,初步鉴定为芽孢杆菌属(Bascillus)。通过该破乳菌发酵条件的优化得到,当温度为25°C,摇床转数为160r/min,pH值为9,接菌量为20%时该破乳菌生长速率最快,积累发酵产物的量最多;当温度为35°C,摇床转数为120r/min,pH值为9,接菌量为2%时该破乳菌代谢产物的破乳活性最高。