关于《破骨细胞刺激性跨膜蛋白诱导铁死亡促进矽肺纤维化》一文的更正

《环境与职业医学》2023年第11期发表《破骨细胞刺激性跨膜蛋白诱导铁死亡促进矽肺纤维化》(引用格式:吴静,左翠云,柯妍妍,等.破骨细胞刺激性跨膜蛋白诱导铁死亡促进矽肺纤维化[1].环境与职业医学,2023,40(11):1257-1263.)。应作者要求:①第1257页作者署名中“许雅萍”修改为“许雅苹”;②第1257页基金项目中“福建省自然科学基金项目(2022J011409,2023J0113)”修改为“福建省自然科学基金项目(2022J011409,2023J011653)”。

破骨细胞刺激性跨膜蛋白诱导铁死亡促进矽肺纤维化

破骨细胞刺激性跨膜蛋白(OC-STAMP)参与二氧化硅(SiO_(2))暴露引起矽肺纤维化,其通过诱导肺泡Ⅱ型上皮细胞铁死亡从而参与矽肺纤维化的作用及相关机制尚不明确。[目的]探讨SiO_(2)暴露下OC-STAMP调控肺泡Ⅱ型上皮细胞铁死亡参与大鼠矽肺纤维化的作用及可能机制。[方法]20只SPF级Wistar雄性大鼠,随机分为2组,每组10只,分别为对照组(Sham组)、SiO_(2)组。SiO_(2)组大鼠通过气管非暴露法一次性给予1 mL 50 mg·L^(-1)的SiO_(2)混悬液建立矽肺动物模型,Sham组大鼠采用同样的方法给予1 mL0.9%氯化钠溶液,8周后处死大鼠。取左下肺固定于戊二醛或多聚甲醛,用透射电镜观察线粒体超微结构;用HE染色、Masson染色、VG染色及普鲁士蓝染色显示肺组织结构变化及铁沉积状况。通过免疫组化和免疫荧光评价OC-STAMP表达水平和肺纤维化程度。采用实时荧光定量PCR检测大鼠肺组织OCSTAMP表达水平及验证OC-STAMP的转染效果。培养MLE-12细胞,通过转染OC-STAMP质粒或OC-STAMP小干扰RNA(siRNA)构建过表达(OCS组)和抑制表达(SI-OC组)模型。采用Western blotting法检测肺组织及MLE-12中谷胱甘肽过氧化物酶4(GPX4)、溶质载体家族7成员11(SLC7A11)等蛋白的相对表达量。[结果]SiO_(2)暴露8周后,HE、Masson和VG染色结果显示造模成功;组织免疫荧光结果显示,OC-STAMP与ATP结合盒亚家族A成员3(ABCA3)共定位于肺泡Ⅱ型上皮中;免疫组化结果显示,SiO_(2)组OC-STAMP、Ⅰ型胶原表达水平与Sham组相比升高(P<0.01);实时荧光定量PCR结果显示,SiO_(2)组肺组织中OC-STAMP的mRNA高于Sham组(P<0.01);肺组织普鲁士蓝染色结果显示在SiO_(2)组可见阳性棕黄色颗粒;经透射电镜观察,Sham组线粒体结构正常,SiO_(2)组线粒体普遍肿胀,线粒体嵴溶解、消失;肺组织免疫印迹结果显示,在SiO_(2)组,SLC7A11、GPX4蛋白表达水平降低(P<0.05,P<0.01),Vimentin蛋白表达水平增加(P<0.01);在转染的MLE-12细胞中,与Sham组相比,OCS组SLC7A11、GPX4蛋白表达水平降低(P<0.01,P<0.01)。[结论]OC-STAMP可能通过影响铁死亡相关蛋白表达,从而促进SiO_(2)暴露导致的肺纤维化。

MITF在破骨细胞中的作用研究进展

MITF(microphthalmia-associated transcription factor,MITF)是小眼畸形相关转录因子,它在破骨细胞中的作用成为近几年骨科领域的研究热点。不断有研究证实,MITF调节破骨细胞中众多功能相关基因的转录,包括抗酒石酸酸性磷酸酶(tartrateresistant acid phosphatase,TRAP),组织蛋白酶K(Cathepsin K),破骨细胞相关受体(osteoclast-associated receptor,OSCAR),氯离子通道-7(chloride channel-7,Clcn7),骨硬化相关跨膜蛋白-1(osteopetrosis-associated transmembrane protein 1,Ostm1)和E-钙粘蛋白(E-cadherin)等。无论在MITFmi/mi突变的小鼠模型还是来源于MITFmi/mi突变的小鼠体外培养的破骨样细胞中,我们都能检测到上述与破骨细胞众多功能相关基因的表达都会受到明显抑制,导致破骨细胞功能异常,小鼠患有严重的骨硬化病。因为小鼠和人类的MITF基因序列具有很高的同源性,所以理解MITF调控系统对小鼠破骨细胞的作用也将有助于我们阐明妇女绝经后的骨质疏松症、骨硬化病或者发生在多发性骨髓瘤患者身上的溶骨性骨质破坏和高钙血症等人类疾病的分子作用机制。现就MITF在破骨细胞中的作用做一综述。

OC-STAMP及其在巨噬细胞系细胞融合中作用机制的研究进展

破骨细胞(OC)是唯一执行骨吸收功能的细胞,来源于单核细胞/巨噬细胞谱系。在OC形成过程中,前体OC融合形成多核成熟OC。而细胞融合是一个非常复杂的生物学过程,需要一些特殊蛋白或分子参与。OC多次跨膜蛋白(OC-STAMP)是近年来新发现的细胞融合分子。在OC-STAMP基因敲除的小鼠体内,OC和外源异物巨噬细胞的融合都被完全抑制,且在OC-STAMP缺乏的OC中,其骨吸收功能也明显下降。目前,OC-STAMP调节细胞融合的机制尚未明确,研究认为OC-STAMP主要通过核因子κB和信号转导及转录激活因子家族所介导的信号通路发挥作用。

OC-STAMP基因过表达载体及稳转细胞系的构建

目的构建破骨细胞多次跨膜蛋白(OC-STAMP)基因过表达质粒,体外转染RAW264.7细胞构建稳转细胞系,为进一步研究OC-STAMP的功能提供工具。方法根据NCBI数据库中OC-STAMP基因信息,设计引物,采用PCR扩增其基因片段;运用基因重组方法双酶切目的基因,并将其克隆至含有绿色荧光蛋白(GFP)的p CDH-CMV慢病毒载体,经酶切测序对重组质粒进行鉴定;转染成功构建的质粒至293T细胞中Western blotting验证蛋白过表达情况;采用ps PAX2和p MD2.G两种包装质粒包装p CDH-CMV-oc-stamp重组质粒获得病毒液,病毒感染RAW264.7细胞获得OC-STAMP过表达稳转细胞系,Q-PCR和Western blotting验证蛋白过表达情况。结果酶切和测序鉴定表明成功构建p CDH-CMV-oc-stamp的基因重组质粒;将成功构建的p CDH-CMV-oc-stamp质粒转染至293T,可观察到大量绿色荧光表达;将成功包装获得的病毒液感染RAW264.7细胞后q-PCR及Western blotting结果证实OC-STAMP成功过表达。结论成功构建p CDH-CMV-oc-stamp重组质粒及OC-STAMP过表达的稳转细胞系。

肺泡Ⅱ型上皮细胞过表达OC-STAMP诱导肌动蛋白细胞骨架重塑促进上皮-间质转化的机制

目的:探讨过表达破骨细胞刺激性转膜蛋白(osteoclast stimulatory transmembrane protein,OC-STAMP)对上皮-间质转化的作用及机制。方法:于2021年4月,将小鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞MLE-12细胞分为过表达对照组(NC组)、 Ocstamp过表达组(over- Ocstamp组)、法舒地尔(Fasudil)干预组(over- Ocstamp+Fasudil组)、沉默对照组(si-NC组)、 Ocstamp沉默组(si- Ocstamp组)。采用蛋白免疫印迹(Western blotting)法、免疫细胞化学染色法检测OC-STAMP、上皮标志蛋白E-钙黏蛋白(E-cadherin,E-cad)、间质标志蛋白α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)、Ras基因家族成员A(Ras homolog gene family member A,RhoA)、Rho GDP解离抑制因子α(Rho GDP dissociation inhibitor α,Rho GDIα)、Rho相关蛋白激酶(Rho-associated protein kinase,ROCK)、磷酸化肌球蛋白磷酸酶(phosphate myosin phosphatase,p-MYPT)蛋白表达,采用鬼笔环肽法检测细胞骨架肌动蛋白(filamentous actin,f-actin)的变化。采用 t检验比较两组间各蛋白的相对表达量。 结果:Western blotting及免疫细胞化学染色法结果显示,与NC组比较,over- Ocstamp组E-cad蛋白表达下调,α-SMA、Rho GDIα、RhoA、ROCK、p-MYPT蛋白表达增加,F-actin表达增强,差异均有统计学意义( P<0.05);与si-NC组比较,si- Ocstamp组E-cad和α-SMA蛋白表达差异均无统计学意义( P>0.05);与over- Ocstamp组比较,over- Ocstamp+Fasudil组E-cad蛋白表达上调,α-SMA、Rho GDIα、RhoA、ROCK、p-MYPT蛋白表达下降,F-actin表达减弱,差异均有统计学意义( P<0.05)。 结论:肺泡Ⅱ型上皮细胞过表达OC-STAMP,可能通过激活Rho GDIα/RhoA/ROCK信号通路,诱导肌动蛋白细胞骨架重塑,进而促进上皮-间质转化。

高通量转录组测序研究过表达Ocstamp对MLE-12细胞基因表达的影响

目的 研究过表达Ocstamp对MLE-12细胞基因表达的影响。方法 构建稳定过表达Ocstamp和空载对照(NC)的MLE-12细胞并进行高通量转录组测序和生物信息学分析。蛋白免疫印迹法检测p-毛细血管扩张性共济失调突变激酶(ATM)、p-毛细血管扩张性共济失调(ATR)、p-p53、p21、p16、Ⅰ型胶原蛋白(Col Ⅰ)、Ⅲ型胶原蛋白(ColⅢ)、Ⅺ型胶原蛋白(Col Ⅺ)、己糖激酶2(HK2)、乳酸脱氢酶A(LDHA)、磷酸果糖激酶1(PFK1)、M2型丙酮酸激酶(PKM2)的表达,β半乳糖苷酶染色法检测细胞衰老。结果 高通量转录组测序结果显示,与NC组相比,过表达Ocstamp的MLE-12细胞中有2 794个差异基因,其中GO分析和KEGG分析显示衰老信号、糖酵解信号和胶原沉积信号出现了异常激活,蛋白免疫印迹结果显示,与NC组相比较,p-ATM、p-ATR、p-p53、p21、p16、Col Ⅰ、IColⅢ、Col Ⅺ、HK2、LDHA、PFK1、PKM2在Ocstamp过表达组中均上调(P<0.05),且β半乳糖苷酶染色阳性。结论 过表达Ocstamp能介导MLE-12细胞衰老信号、糖酵解信号和胶原沉积等异常活化。