破骨细胞抑制性凝集素胞外段可抑制骨髓干细胞向破骨细胞分化

目的:在大肠杆菌中表达人破骨细胞抑制性凝集素(OCIL)胞外段重组蛋白,体外检测表达的重组蛋白活性。方法:通过修改OCIL胞外段编码的碱基序列和重组PCR方法得到连续DNA片段;将表达载体pMAL-c2x/hOCIL转化入BL21(DE3)plysS宿主菌,IPTG诱导表达。利用直链淀粉亲和层析柱分离纯化,Western blotting鉴定重组蛋白。体外培养小鼠股骨骨髓细胞,在巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)和核因子κB受体活化因子配基(RANKL)诱导骨髓细胞向破骨细胞分化的基础上,加入不同浓度的重组蛋白,观察其对破骨细胞样细胞生成的影响。结果:重组菌中确有融合蛋白MBP-hOCIL表达,其中目的蛋白占纯化液总蛋白的91.36%,纯化后重组融合蛋白产率为24.3mg/L培养基;所制备的重组蛋白对小鼠骨髓破骨细胞样细胞的形成有抑制作用。结论:本研究通过基因工程的方法成功获得了hOCIL胞外段重组蛋白,此蛋白在体外可以明显抑制破骨细胞样细胞的形成。

甲状旁腺素（1-34）对破骨细胞抑制性凝集素表达的调节及信号转导机制

目的探讨甲状旁腺素（parathyroidhormone，PTH）（1_34）对UMRl06成骨细胞表达破骨细胞抑制性凝集素（osteoclastinhibitorylectin，OCIL）基因mRNA的调节及其信号转导机制。方法培养大鼠UMRl06成骨细胞，采用胛H（1—34）及蛋白激酶A（PKA）、蛋白激酶C（PKC）、钙离子、MAPK通路的激动剂或阻断剂干预细胞不同时间后，收集细胞提取总RNA，实时荧光定量PCR检测OCILmRNA的表达水平。结果PTH（1-34）以剂量和时间依赖方式促进OCILmRNA表达。10nmol／LPTH（1-34）作用6h后促进OCILmRNA表达，24h上调效应最显著，约为对照组[未加入PTH（1-34）]的2．8倍。PTH（1_34）对OCILmRNA表达促进作用的起始时间及高峰时间均晚于其对RANKL的诱导和对OPG的抑制。蛋白激酶A通路激动剂福司可林（FSK）、双丁酰基环腺苷磷酸（db．cAMP）及钙离子载体A23187均不同程度促进OCILmRNA表达，最大上调效应分别约为对照组的4．2、4．5和5．1倍。蛋白激酶C激动剂佛波酯（PMA）作用早期（2～6h）抑制OCILmRNA表达，作用6h后最大抑制率达50％；PMA作用后期（24h）对OCILmRNA的抑制作用逆转为促进效应。PKA阻断剂KT5720、钙调蛋白（CaMK）阻断剂W-7、钙调蛋白激酶Ⅱ阻断剂KN-62及丝裂原激活的蛋白激酶（MAPK）阻断剂PD98059均下调胛H（1-34）诱导的OCILmRNA表达，最大抑制率分别为56％、61％、63％和50％。各信号通路间存在交互作用。MAPK通路阻断剂PD98059减少PKA激动剂FSK或db—cAMP诱导的OCILmRNA表达，抑制率分别为98％和63％；但不影响A23187诱导的OCILmRNA水平增高。结论PKA通路、钙／钙调蛋白通路和MAPK通路可介导PTH（1-34）诱导的OCILmRNA表达。

OCILRP2-Fc抑制小鼠骨髓来源的树突状细胞分化成熟

目的:采用OCILRP2胞外段蛋白OCILRP2-Fc阻断OCILRP2受体,探讨OCILRP2对小鼠树突状细胞发育成熟的影响及其机制。方法:分离培养小鼠骨髓来源的树突状细胞(BMDC),荧光定量RT-PCR和流式细胞术分析OCILRP2在不成熟BMDC和LPS诱导的成熟BMDC的表达差异;流式细胞术分析OCILRP2-Fc对BMDC细胞表面标志分子的表达以及对BMDC抗原摄取能力的影响;ELISA检测培养上清中细胞因子的浓度,分析OCILRP2-Fc对BMDC分泌炎性细胞因子的影响;Western blot检测转录因子NF-κB的活化,分析OCILRP2-Fc影响BMDC分化成熟的分子机制。结果:荧光定量RT-PCR和流式细胞术结果均表明LPS可以显著上调OCILRP2在BMDC的表达(P<0.05);与对照组相比,OCILRP2-Fc可以明显抑制MHCⅡ类分子及共刺激分子CD80在LPS诱导的成熟BMDC的表达;和成熟BMDC相比,OCILRP2-Fc组BMDC经LPS诱导24 h后仍然具有较强的抗原吞噬能力;而且,OCILRP2-Fc组BMDC培养上清中炎性细胞因子IL-6、IL-12、TNF-α的浓度明显低于对照组(P<0.05)。Western blot结果表明OCILRP2-Fc抑制了LPS诱导的I-κB降解和NF-κB p65的磷酸化。结论:OCILRP2-Fc阻断OCILRP2受体信号,通过抑制LPS诱导的NF-κB活化影响小鼠BMDC分化成熟。提示OCILRP2受体在树突状细胞的分化成熟过程中具有促进作用。

破骨细胞抑制凝集素相关蛋白2对小鼠内毒素血症的保护作用

目的：研究重组破骨细胞抑制凝集素相关蛋白2胞外段蛋白（OCILRP2-Fc）阻断OCILRP2受体信号对LPS诱导的内毒素血症的影响，探讨OCILRP2受体在机体炎症反应中的作用。方法荧光定量RT-PCR检测LPS刺激前后OCILRP2在RAW264．7细胞的表达；小鼠腹腔注射20mg/kg体重的LPS诱导内毒素血症的发生，分析OCILRP2-Fc对内毒素血症小鼠存活率的影响；称量小鼠脾脏重量分析脾脏充血肿大情况；HE染色观察肺脏、肝脏组织病理损伤情况；ELISA检测小鼠血清中炎症性细胞因子的水平；Westernblot检测LPS刺激前后巨噬细胞中NF-κB的活化。结果荧光定量RT-PCR结果表明LPS刺激显著提高了OCILRP2在小鼠巨噬细胞的表达（P＜0．05）；与对照组相比，OCILRP2-Fc可以显著提高内毒素血症小鼠的存活率；减轻小鼠脾脏肿大程度和内毒素血症对肺脏和肝脏组织造成的病理损伤；降低血清中细胞因子IL-6、IL-12、TNF-α和IFN-γ的浓度（P＜0．05）。Westernblot结果表明OCILRP2-Fc抑制LPS诱导的RAW264．7细胞内IκB的降解和NF-κBp65的磷酸化。结论采用OCILRP2-Fc阻断OCILRP2受体信号，减轻了小鼠内毒素血症对机体造成的炎症性损伤，提示OCILRP2在LPS诱导的炎症反应发生过程中具有促进作用。

前列腺素E2调节大鼠成骨细胞OCIL基因表达的信号通路研究

探讨前列腺素E2（PGE2）对大鼠成骨细胞破骨细胞抑制性凝集素（osteoclast inhibitory lectin OCIL）mRNA表达的调节及其信号转导机制。培养大鼠原代成骨细胞和UMR106成骨细胞样细胞，采用不同浓度的PGE2和不同的信号通路调节剂干预细胞后，提取细胞总RNA，采用实时荧光定量PCR检测OCIL mRNA的表达水平。PGE2、蛋白激酶A（PKA）激动剂福司可林、db—cAMP和钙离子载体A23187均促进OCIL mRNA表达，OCIL mRNA最大上调幅度分别为对照组的2．38倍、4．2倍、4．5倍和5．1倍（均P〈0．01）。蛋白激酶c（PKC）激动剂PMA下调OCIL mRNA表达约50％（P〈0．01）。PKA抑制剂KT-5720、钙通道阻断剂维拉帕米、钙调蛋白抑制剂W7和丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）阻断剂PD98059分别下调PGE，诱导的OCIL mRNA表达约56％、40％、65％和60％（均P〈0．01）。PKC抑制剂白屈菜红碱促进PGE2诱导的OCIL mRNA表达约30％（P〈0．05）。PKA、MAPK和Ca^2＋／钙调蛋白信号通路介导了PGE2诱导的大鼠成骨细胞OCIL基因表达。

维生素D调控OC形成的差异蛋白表达及生物信息学分析

旨在研究维生素D对破骨细胞(osteoclast,OC)形成中蛋白表达的影响。本试验利用差异蛋白组学检测1α,25-(OH)2D3处理后蛋白表达的变化,并对差异表达蛋白进行生物信息学分析。结果表明,质谱鉴定获得23个差异表达蛋白点,除去蛋白亚型,实际为19种蛋白。主要涉及氧化还原、结合与能量代谢等分子功能,参与细胞凋亡、蛋白折叠调控等生物学过程。其中,巨噬细胞游走抑制因子(MIF)、半乳糖凝集素-3(Gal-3)、膜联蛋白A2(Anxa2)、原肌球蛋白α-3链亚型X6(Tpm3)及SH3域结合谷氨酸富含样蛋白3(Sh3bgrl3)与OC形成密切相关。本试验为动物钙磷代谢紊乱性疾病研究奠定了基础。