骨髓间充质干细胞通过抑制破骨细胞相关因子改善膝关节骨性关节炎

目的探讨骨髓间充质干细胞是否通过抑制破骨相关因子改善膝关节骨性关节炎。方法将40只健康SPF级SD大鼠随机分为空白组、模型组、甲氨蝶呤组和骨髓间充质干细胞组,每组8只,剩余8只用于骨髓间充质干细胞的分离。除空白组外,其余组采用木瓜蛋白酶关节腔注射建立膝关节骨性关节炎大鼠模型。造模成功后第2天起空白组和模型组大鼠膝关节腔注射生理盐水0.3 ml;甲氨蝶呤组大鼠腹腔注射甲氨蝶呤(0.5 mg/kg);骨髓间充质干细胞组大鼠膝关节腔内一次性注射骨髓间充质干细胞0.3 ml,同时每周1次膝关节腔内注射生理盐水0.3 ml,每周1次,共4次。4次干预结束后各组大鼠进行关节指数(AI)评分;苏木素-伊红(HE)染色观察软骨组织病理学变化;酶联免疫吸附法(ELISA)检测血清RANKL、OPG、CXCL10含量;实时荧光定量(qRT-PCR)检测软骨组织RANKL、OPG、TRAF6、CXCL10、CXCR3 mRNA表达;蛋白质印迹法(Western blot)检测软骨组织RANKL、OPG、TRAF6、CXCL10、CXCR3蛋白表达。结果与空白组比较,模型组大鼠AI评分,血清RANKL、OPG、CXCL10含量,软骨组织RANKL、OPG、TRAF6、CXCL10、CXCR3 mRNA和蛋白表达明显升高(P<0.05)。与模型组比较,甲氨蝶呤组大鼠AI评分、血清OPG、CXCL10含量及软骨组织TRAF6、CXCL10、CXCR3蛋白表达明显降低(P<0.05);骨髓间充质干细胞组大鼠AI评分、血清RANKL、OPG、CXCL10含量、软骨组织RANKL、OPG、TRAF6、CXCL10、CXCR3 mRNA和蛋白表达明显降低(P<0.05)。与甲氨蝶呤组比较,骨髓间充质干细胞组大鼠AI评分、血清RANKL、OPG、CXCL10含量、软骨组织RANKL、OPG、TRAF6、CXCL10、CXCR3 mRNA和蛋白表达均差异无统计学意义(P>0.05)。结论骨髓间充质干细胞明显改善膝关节骨性关节炎病理损伤,作用效果与甲氨蝶呤作用效果相当,可能通过调节RANKL/OPG/TRAF6信号通路发挥对膝关节骨性关节炎大鼠的治疗作用。

巨噬细胞集落刺激因子过表达对信号通路中破骨相关因子的影响

目的:探讨巨噬细胞集落刺激因子(monocyte colony-stimulating factor,M-CSF)在SD大鼠骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)中过表达对破骨细胞分化形成相关细胞因子在信号通路中表达的影响。方法:构建过表达质粒载体上调M-CSF基因表达,使用增强型绿色荧光蛋白确定最佳转染剂量,并将质粒转染至BMSCs。采用逆转录-聚合酶链反应(reverse transcriptase polymerase chain reaction,RT-PCR)检测破骨分化特异标志物M-CSF、核因子-κB受体活化因子配体(receptor activator of nuclear factor-kappaB ligand,RANKL)、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-alpha,TNF-α)、白细胞介素-1(interleukin-1,IL-1)、白细胞介素-6(interleukin-6,IL-6)、白细胞介素-24(interleukin-24,IL-24)的mRNA表达水平。结果:流式鉴定BMSCs表面标记物CD29、CD44阳性率为91.4%、85.7%;CD45阳性率为2%;每孔5μL LTX为最佳转染效率;RT-PCR检测结果显示,实验组BMSCs中M-CSF mRNA表达显著升高(P<0.001);BMSCs破骨分化特异标志物RANKL、TNF-α、IL-1、IL-24 mRNA表达均显著增高(P<0.001),IL-6 mRNA表达降低(P<0.001),实验组与对照组比较差异有统计学意义。结论:M-CSF过表达增强BMSCs向破骨细胞分化的能力,对破骨细胞形成分化的早中晚期均存在影响。此外,M-CSF高表达质粒将外源基因导入BMSCs,是一种强有力的骨再生的基因治疗工具。