内蒙地区砷暴露人群p16基因甲基化的分析

目的了解内蒙地区砷暴露人群p16基因甲基化发生情况,从分子水平揭示砷化物的致癌机制。方法分别在饮水型砷中毒流行区选取40例典型确诊地方性砷中毒患者、40名流行区非患者以及40名非流行区的正常人,作为本研究的病例组和2个对照组,采用甲基化特异性PCR(MS-PCR)技术,测定各组人群血标本p16基因甲基化水平,并做χ2检验。结果病例组、流行区对照组与非流行区对照组的p16基因甲基化率分别为:65.0%、47.5%和20.0%,且随砷中毒流行区的饮水砷暴露强度增加而增加,组间有显著性差异(P<0.005)。结论饮水型砷暴露与人群p16基因甲基化发生率增高有关。

GSTT1和GSTM1基因多态性与人体砷甲基化代谢水平关系探讨

目的探讨GSTT1、GSTM1基因多态性与人体砷甲基化代谢水平之间的关系。方法选择某工业性砷污染区的247名成年常住居民为研究对象。采用多重PCR法检测GSTM1和GSTT1基因多态性。离子色谱氢化物发生原子荧光法(IC-HG-AFS)测定尿中无机砷(iAs)、一甲基胂酸(MMA)和二甲基胂酸(DMA)。结果GSTT1缺失基因型人群与GSTT1非缺失基因型人群尿中iAs比例、DMA比例和MMA比例相比较,差异均无统计学意义(P>0.05)。GSTM1缺失基因型人群与GSTM1非缺失基因型人群尿中iAs比例、DMA比例和MMA比例相比较,差异均无统计学意义(P>0.05)。四组不同GSTT1和GSTM1联合基因型人群尿中iAs比例、DMA比例和MMA比例相比较,四组间差异也均无统计学意义(P>0.05)。结论本研究未发现GSTT1、GSTM1基因多态性与砷代谢水平之间存在显著关联。

无机砷甲基化产物与砷代谢相关基因研究进展

砷对人体具有致癌性,与心血管疾病、糖尿病等疾病有关。砷在体内的代谢是一个极其复杂的过程,而调控砷代谢的相关基因在砷的代谢过程中起到了重要的作用,同时也解释了砷中毒的易感性问题。目前对于砷代谢的过程存在不同学说,对于砷代谢相关基因与砷代谢产物的关系以及砷中毒的易感性等问题,不同地区的报道也有差别。本文就砷甲基化的过程和产物、砷代谢相关基因研究的进展以及今后的研究方向展开阐述。

砒霜厂工人Bcl-2基因相对表达与尿砷甲基化产物的关系

目的探讨砷职业暴露人群Bcl-2基因表达与甲基砷酸的关系,识别砷的遗传毒性.方法整群抽取砒霜厂工人43名作为暴露组,对照组23人.实时荧光定量PCR检测砒霜厂工人外周血淋巴细胞Bcl-2基因,采用氢化物发生原子吸收分光光度法检测尿中各形态砷化合物和总砷含量,并计算一、二级甲基化指数.结果职业暴露工人尿中无机砷、甲基砷酸、二甲基砷酸均显著高于对照人群;职业暴露工人二级甲基化指数显著低于对照人群;职业暴露工人外周血淋巴细胞Bcl-2基因相对表达显著高于对照人群;尿中总砷与Bcl-2相对表达量成显著正相关(r=0.272,P<0.05),MMA与Bcl-2相对表达量成显著正相关(r=0.252,P<0.05),DMA与Bcl-2相对表达量成显著正相关(r=0.280,P<0.05);尿中砷二级甲基化指数与Bcl-2基因相对表达量成显著负相关(r=-0.424,P<0.05).结论砷暴露是工人外周血淋巴细胞Bcl-2基因表达升高的原因,并和甲基化过程密切相关.

微生物砷甲基化及挥发研究进展

砷(As)是一种全球关注的有毒元素。在自然环境中,砷主要以无机形态存在。环境微生物对无机砷的甲基化及挥发对砷的生物地球化学循环有重要影响。利用微生物砷挥发来削减土壤砷浓度,是具有应用前景的土壤修复技术。本文综述了砷甲基化机理、砷甲基化基因起源和进化的最新进展,不同物种之间砷甲基化基因的水平转移是该基因传播的主要途径;阐述了目前报道的砷甲基化过程的几种可能机制。鉴于微生物砷甲基化在生物地球化学循环及环境健康方面的重要作用,该综述对未来该领域研究有重要指导意义。

土壤中砷的生物转化及砷与抗生素抗性的关联

砷是一种广泛存在于自然环境中毒性较强的类金属元素,农田生态系统中的植物(尤其水稻)很容易吸收积累土壤环境中的砷。植物中的砷沿食物链向高等动物传递,威胁人类健康。除土壤本身的理化性质外,土壤中砷的生物转化也强烈影响砷的生物有效性。目前研究发现异化砷酸盐(As(Ⅴ))呼吸性还原、细胞质As(Ⅴ)还原、亚砷酸盐(As(Ⅲ))氧化、As(Ⅲ)甲基化和有机砷的去甲基化在土壤砷的生物地球化学过程中起重要作用。随着分析化学和分子生物学技术的进步,最新研究发现土壤生物也参与了砷糖、砷糖磷脂、砷甜菜碱、砷代草丁膦、硫代砷等有机砷的合成,其中三价一甲基砷和砷代草丁膦可作为新型抗生素,但其合成机制及生态学功能有待进一步研究。本文还详细介绍了为适应复合污染环境微生物通过自身的进化对抗生素和重金属形成的四种共选择抗性机制:共抗性,交叉抗性、共调控和生物膜感应,特别提出了土壤中砷污染与抗生素抗性相关联这一新的研究方向。最后对砷生物转化和砷与抗生素共抗机制的未来研究方向做了展望。

无机砷对人支气管上皮细胞p16基因甲基化及表达的影响

目的 观察亚砷酸钠 (NaAsO2 )和砷酸钠 (Na3 AsO4 )对人支气管上皮BEP2D细胞p16基因甲基化及表达的影响。方法 采用甲基化特异性PCR(MSP)及RT PCR等技术观察分析BEP2D细胞p16基因甲基化和表达水平。结果 (1)NaAsO2 (0 0 16～ 2 μmol/L)和高浓度组Na3 AsO4 (80和16 0 μmol/L) 具有促进BEP2D细胞p16基因二核苷酸CpG岛甲基化作用 ;而低浓度组Na3 AsO4 (2 0和40 μmol/L) 不能使BEP2D细胞p16基因CpG岛发生甲基化。 (2 )无机砷可使BEP2D细胞p16基因表达下降 ,且NaAsO2 较Na3 AsO4 更为明显。结论 无机砷可引起BEP2D细胞p16基因CpG岛甲基化程度增高和表达水平下降 ,提示p16基因高甲基化是无机砷致癌的可能途径之一。

多发性骨髓瘤患者p16基因甲基化及砷剂诱导去甲基化的研究

目的探讨p16基因启动子区CpG岛甲基化在多发性骨髓瘤(MM)患者发病中的作用以及三氧化二砷(As2O3)诱导p16基因的去甲基化作用。方法采用巢式甲基特异性PCR法检测MM患者以及利用As2O3作用前后人MM细胞株U266的p16基因的甲基化状态,RTPCR检测U266细胞用药前后p16基因mRNA的表达变化,生长曲线、MTT法检测As2O3对细胞的生长和增殖抑制。利用流式细胞仪检测DNA含量分析法探讨As2O3对骨髓瘤细胞系U266周期的影响。结果MM患者p16基因的甲基化比例为54.8%,U266细胞存在p16基因甲基化,p16基因不表达,As2O3作用后p16基因甲基化程度明显减弱至消失,与未处理组相比,不同剂量作用72h后p16基因表达阳性条带灰度值与βactin比值分别为0.22±0.10、0.59±0.11、0.68±0.09,阳性对照灰度比值为0.77±0.13,其差异有统计学意义(P<0.01)。结论p16基因甲基化在MM患者中较为常见,这可能为MM的诊断和治疗提供借鉴;As2O3可诱导p16基因去甲基化,使p16基因表达上调,恢复其活性,为去甲基化治疗提供新思路。

亚砷酸钠对HaCaT细胞MGMT基因甲基化和mRNA及蛋白表达水平的影响

目的 了解不同剂量亚砷酸钠（NaAsO2）处理的人皮肤角质形成细胞（HaCaT细胞）中MGMT基因甲基化特征,以及MGMT基因甲基化对其转录和表达的调控.方法 以3.13、6.25、12.50、25.00 μmol/L NaAsO2重复间隔处理HaCaT细胞72 h.硫化测序PCR（BSP）检测MGMT基因转录起始点-329～＋93甲基化热点区域,实时荧光定量PCR（Q-PCR）及免疫印迹分析（Westem blotting）检测MGMT基因的mRNA及蛋白表达.设不染毒的HaCaT细胞为空白对照,人表皮鳞癌细胞株A431为阳性对照.结果 3.13、6.25、12.50、25.00μmol/L NaAsO2处理组,MGMT基因启动子区DNA甲基化水平分别为0.63%（1/160）、6.25%（10/160）、10.63%（17/160）和18.75%（30/160）.且甲基化的CpG位点主要位于转录起始点-249～-146区域,空白对照组未检出甲基化,组间比较差异有统计学意义（x2=76.687,P〈0.05）;3.13、6.25、12.50、25.00 μmol/L NaAsO2处理组MGMT mRNA相对表达量分别为1.518 31±0.180 54、1.425 22±0.180 39、1.014 54 ±0.096 79、0.887 72 ±0.020 00,与空白对照组（1.198 29±0.159 97）比较,差异有统计学意义（F=37.359,P〈0.05）;3.13、6.25、12.50、25.00 μmol/L NaAsO2处理组MGMT蛋白相对表达量分别为1.174 47±0.064 75、0.848 83 ±0.057 01、0.471 63±0.023 34、0.240 34±0.014 43,与空白对照组（1.066 19±0.061 24）比较,差异有统计学意义（F=20.687,P〈0.05）.结论 砷通过导致MGMT基因启动子区CpG岛高甲基化.抑制MGMT基因mRNA转录及蛋白表达,是砷致皮肤损害的重要机制之一.

砷致癌动物模型研究现状

人类流行病学资料显示,长期暴露于砷化合物可以导致人类皮肤、肺、膀胱、肝和肾脏的癌症。近来报道指出,砷在小鼠和大鼠的相应器官也可诱发促癌或完全致癌作用,给予p53+/-和K6/ODC转基因小鼠无机砷的甲基化代谢产物二甲基胂酸(DMA)或亚砷酸盐,对转基因小鼠的皮肤或膀胱有一定程度的致癌、联合致癌或促癌作用。由于到目前为止尚无无机砷化合物致癌的动物模型,致使其致癌机制的研究一直滞后,所以大量研究人员致力于野生型和转基因动物的砷致癌动物模型研究,本文就这一方面的研究进展做一综述。

AS3MT酶基因单核苷酸多态性对砷甲基化代谢能力及发病风险的研究

砷是国际癌症研究机构(IARC)确认的人类的Ⅰ类致癌物质[1].饮水砷暴露是其主要的环境暴露方式,饮水中的砷主要为无机砷(iAs).长期环境高砷暴露会引发膀胱癌、肺癌、皮肤癌等癌性损伤以及周围血管疾病("黑脚病"、动脉硬化)、神经病变等非癌性损伤[2].由于砷暴露涉及范围广、威胁人口多、病情危害大,现已在世界范围内成为一个严重的公共卫生问题,并且是全球单一元素生物学作用及其危害研究的热点.经流行病学调查研究发现,饮用相同含砷水源的人群并不都患病,并且个体间因砷暴露表现出疾病症状的轻重程度也不完全相同[3].这种现象提示,除个体因素外,遗传因素在砷中毒发病的过程中也可能起着重要作用[4].其中,参与砷甲基化代谢的酶基因的多态性对砷的甲基化代谓t及中毒发病风险影响的研究成为近年来的一个研究热点.

K562细胞TMS1基因甲基化状态及三氧化二砷对其去甲基化作用

目的探讨慢性髓性白血病细胞系K562细胞甲基化诱导静止基因（TMS1）甲基化程度及三氧化二砷（As2O3）对其甲基化状态的逆转作用及其机制。方法K562细胞经不同浓度As2O3处理48h，采用甲基化特异性PCR（MsP）法检测As2O3处理前后K562细胞TMS1基因甲基化程度；RT-PCR及Westernblot法检测As2O3处理前后K562细胞TMS1mRNA及蛋白表达，Westemblot法检测凋亡蛋白Bcl-2、Bax表达水平的变化；用细胞凋亡检测试剂盒（Annexin V／PI）标记、流式细胞术检测细胞凋亡。结果K562细胞TMS1基因呈完全甲基化，TMS1mRNA及蛋白呈低表达状态，相对表达水平分别为0．01＋0．01、0．09~0．02；2jgnol／LAs2O3可完全逆转K562细胞TMS1的甲基化水平，TMS1mRNA及蛋白相对表达水平分别为0．72±0．04和1．3±0．06，与处理前相比明显升高（P〈0．01）；细胞凋亡检测结果显示，与对照组相比，2gmol／LAs2O3处理组细胞凋亡率明显增加[（2．05±0．16）％对（12．24±1．06）％，P〈0．05）]。与对照组相比，2μmol／LAs2O3处理组K562细胞抗凋亡蛋白Bcl-2表达降低，促凋亡蛋白Bax表达明显增高，Bcl-2／Bax比值明显降低（1．94±0．14对0．56士0．12，P〈0．01）。结论As2O3可通过逆转抑癌基因TMS1的甲基化状态，恢复其表达，并通过下调Bcl．2／Bax比值促进K562细胞凋亡。

砷接触工人尿甲基砷酸水平与P53基因损伤的关系

[目的]观察砷职业暴露人群尿甲基砷酸水平与P53基因损伤的关系,深入认识砷的遗传毒性。[方法]选取砒霜厂95名砷接触工人作为暴露组,另选对照组55人,采集外周血和晨尿。用氢化物发生原子吸收分光光度法检测尿中各形态砷化合物和总砷含量,并计算一、二级甲基化指数。实时荧光定量PCR扩增人群外周血淋巴细胞P53基因外显子5和8,通过循环阈值推算损伤后扩增效率,间接计算损伤指数。[结果]暴露组工人尿中无机砷(iAs)、甲基砷酸(MMA)、二甲基砷酸(DMA)均明显高于对照组;暴露组工人二级甲基化指数明显低于对照组;暴露组工人P53基因外显子5和8的损伤指数均明显高于对照组;尿中砷一级甲基化指数与P53基因第5外显子损伤指数存在明显的正相关,尿中砷二级甲基化指数与P53基因第5外显子损伤指数存在明显的负相关。[结论]职业砷暴露工人二级甲基化指数明显增加,体内存在较多甲基砷酸,可能是P53基因外显子5损伤的主要原因。

三价砷甲基转移酶mRNA相对表达与砷甲基化关系的研究

目的观察三价砷甲基转移酶[As(Ⅲ)MT]mRNA在砷中毒患者、病区对照和非病区对照人群中的表达及其与尿砷甲基化水平的关系。方法选取饮水型砷中毒中重度患者、轻度患者、病区对照和非病区对照各6例,采用实时定量RT-PCR技术测定研究对象的淋巴细胞中三价砷甲基转移酶As(Ⅲ)MTmRNA表达,采用原子荧光AFS-9130、形态分析SAP-10检测尿无机砷(iAs)、一甲基胂酸(MMA)、二甲基胂酸(DMA)、总砷(TAs)含量。按PMI=(MMA+DMA)/TAs,SMI=DMA/(MMA+DMA)分别计算一甲基化指数和二甲基化指数。结果中重度组,轻度组、病区对照组人群iAs、MMA、DMA、Tas、PMI、As(Ⅲ)MTmRNA均显著高于非病区对照人群(P<0.05);As(Ⅲ)MTmRNA分别与MMA%(r=0.485,P=0.041)和PMI(r=0.476,P=0.046)呈显著正相关。结论砷暴露可能促进As(Ⅲ)MTmRNA高表达进而引起PMI水平增高导致MMA产生过多。

不同人群GSTO1 mRNA表达及与砷甲基化关系

目的观察谷胱甘肽-S-转移酶(GSTO1)mRNA在砷中毒患者、病区对照和非病区对照人群中的表达及其与尿砷甲基化水平的关系。方法选取饮水型砷中毒重度患者、轻度患者、病区对照和非病区对照各6例,采用实时定量RT-PCR技术测定研究对象的淋巴细胞中GSTO1 mRNA表达,采用AFS-9130、SAP-10检测尿无机砷(iAS)、一甲基胂酸(MMA)、二甲基胂酸(DMA)、尿总砷TAs含量。结果中重度组,轻度组、病区对照组人群iAs,MMA,DMA,TAs一甲基化指数(PMI)均明显高于非病区对照人群(P<0.05);中重度组(P50=1.96),轻度组(P50=1.31)、病区对照组人群(P50=1.23)GSTO1 mRNA表达高于非病区对照人群(P50=1.015)(P<0.05);GSTO1 mRNA表达与MMA%(r=0.206,P=0.112)、DMA%(r=0.098,P=0.700),PMI(r=0.127,P=0.615)和SMI(r=0.192,P=0.445)无相关性。结论GSTO1 mRNA表达与砷甲基化无明显关系,砷中毒引起的损伤可能与砷暴露引起GSTO1mRNA表达增高,并将五价砷化物还原为三价砷化物增多有关。

Raji细胞Id4基因甲基化检测及As2O3对其甲基化影响的研究

目的 研究淋巴瘤细胞DNA结合抑制因子4（inhibitor of DNA binding,Id4）基因甲基化及As2O3去甲基化效应.方法 体外培养人Burkitt＇s淋巴瘤细胞系Raji细胞,设对照组和用不同浓度As2O3处理Raji细胞不同时间的实验组.用甲基化特异性聚合酶链反应（MS-PCR）检测各组Raji细胞Id4基因甲基化程度;逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）检测不同浓度As2O3处理前后Raji细胞Id4mRNA的表达情况.应用MTT比色法检测细胞增殖情况;流式细胞术（FCM）检测细胞凋亡并分析As2O3对细胞周期的影响.结果 ①Raji细胞Id4基因呈完全甲基化状态,Raji细胞Id4基因高甲基化状态可被As2O3逆转,且与As2O3的剂量有关.②不同浓度As2O3处理Raji细胞48 h后,随着药物浓度增加,Raji细胞中Id4基因mRNA的相对表达量逐渐增加,呈一定剂量依赖关系.③不同浓度As2O3处理Raji细胞24、48、72 h后细胞增殖抑制率为12.15%～92.17%,且作用呈时间剂量依赖性（P＜0.05）;④FCM检测细胞凋亡结果显示,As2O3处理Raji细胞48 h后均出现明显的凋亡峰,对照组未见凋亡峰或仅有低平的凋亡峰;⑤FCM细胞周期分析结果显示,不同浓度As2O3处理Raji细胞48 h后,细胞阻滞于G0/G1期,且随着As2O3浓度的增加,阻滞作用增强,呈一定剂量依赖关系.结论 ①人Burkitt＇s淋巴瘤细胞系Raji细胞中Id4基因呈完全甲基化状态.②As2O3可以逆转Raji细胞Id4基因的高甲基化状态,使Id4 mRNA重新表达.③Raji细胞Id4基因呈高甲基化状态是其恶性增殖的原因之一.

稻田落干过程砷甲基化效率变化与关键影响因素分析

研究稻田落干过程砷甲基化效率变化规律,分析关键环境和生物因素的影响,为今后水稻直穗病防控提供科学依据.开展室内培养模拟稻田落干过程,以采集自贵州兴仁(XR)和广西南丹(ND)的两种砷污染水稻土壤为供试土壤,各土壤设置添加(RS)和不添加(CK)水稻秸秆处理,分析自然落干0、24、36、48和60 h过程中Eh、pH、孔隙水总有机碳(TOC)、砷形态、砷甲基化功能基因(arsM)、硫酸盐还原菌(dsrA,砷甲基化相关微生物)、产甲烷菌(mcrA,砷去甲基化相关微生物)丰度和arsM功能微生物多样性变化.稻田落干过程土壤Eh由完全淹水状态下的-300~-200 mV向落干后的-150~-50 mV变迁,而pH值变化规律不明显;孔隙水无机砷(iAs)和二甲基砷(DMAs)浓度随落干过程变化更为显著,总体呈现增加趋势,且RS处理DMAs浓度显著高于CK,ND土壤孔隙水比XR土壤孔隙水DMAs浓度更高;随落干时间延长,XR-CK和XR-RS处理土壤砷甲基化效率有一定提升,但变化不显著,而ND-CK和ND-RS处理土壤砷甲基化效率显著增加.当培养为60 h时,ND-CK和ND-RS处理砷甲基化效率相比培养初期分别提高约61.8%和23.2%;随落干时间延长arsM和dsrA基因拷贝数明显增加,而mcrA基因拷贝数显著下降.秸秆添加后显著提高全细菌和arsM、dsrA和mcrA基因丰度;进一步基于多因素方差分析和冗余分析发现,供试土壤、秸秆添加、落干时间和其交互作用对于各砷形态、砷甲基化效率和关键基因丰度变化影响显著,TOC、Eh和砷甲基化相关基因与甲基态砷呈正向关联,而与无机砷iAs呈负向关联;基于arsM微生物测序发现,伴随落干过程还发生着砷甲基化功能微生物群落的更替.研究结果有助于提升稻田落干过程中砷甲基化变化的理论认知,为今后水稻直穗病科学防控提供指导.

慢性砷暴露致人体生物样品p53、p16启动子区甲基化的改变

[目的]了解砷暴露对人体生物样品中p53、p16启动子区甲基化的影响,探讨p53、p16启动子区DNA甲基化改变及在砷致病中的作用。[方法]于贵州省燃煤污染型地方性砷中毒病区,选择42名常驻居民为暴露组,另于距病区约12 km的非砷暴露村,选择40例居民作为对照组。在知情同意的原则下,采集受试对象尿液、血液和发样,使用电感耦合等离子体质谱(ICP-MS)法检测受试对象尿砷和发砷,采用亚硫酸盐修饰后测序法(BSP)法检测p53、p16启动子区Cp G位点甲基化情况。[结果]暴露组尿砷为(40.59±27.12)μg/g、发砷为(0.32±0.36)μg/g,p53平均甲基化率为(8.32±1.51)%,暴露组-71、+42、+109位Cp G位点甲基化率分别为(11.44±3.64)%,(2.58±1.29)%和(4.98±1.33)%,均高于对照组(均P<0.05);暴露组和对照组p16平均甲基化率和各Cp G位点甲基化率差异均无统计学意义(均P>0.05)。[结论]p53基因启动子区Cp G位点的甲基化与砷暴露有关,砷暴露所致的DNA甲基化可能存在位点的特异性。

一碳单位酶基因单核苷酸多态对砷代谢及中毒的影响

砷是一种已知的毒物和人类致癌物,在自然界中广泛存在。慢性砷暴露可引起皮肤色素异常、过度角化及皮肤和内脏肿瘤为主的全身中毒,其机制到目前为止尚不十分清楚。砷化合物进入机体将发生甲基化代谢,砷甲基化代谢过程的甲基供体S-腺苷基甲硫氨酸(S-adenosyl methionine,SAM)来自以四氢叶酸为中心的一碳单位代谢环路,该环路受多种酶的调节,这些酶的单核苷酸多态性可能会由于影响SAM的供给而间接引起个体甲基化代谢的差异。本综述主要阐述一碳单位代谢环路中关键酶的功能、基因多态性及其与砷代谢和砷中毒发病风险之间的关联。