茶树硒营养代谢关键酶硒半胱氨酸甲基转移酶基因克隆及启动子结构分析

为探明茶树硒营养代谢关键酶基因硒半胱氨酸甲基转移酶(SMT,GenBank登录号:DQ480337)的表达调控规律,通过PCR和基因步移技术获得SMT的DNA全长和部分启动子序列,用PLACE、PlantCARE分析SMT内含子和启动子的序列,预测其顺式作用元件及功能。结果表明,SMT基因全长5473 bp,有7个外显子和6个内含子,内含子富含光响应元件、激素响应元件和抗逆性相关元件。通过基因步移法克隆得到的SMT启动子长375 bp,除了含核心启动子保守元件TATA-box和CAAT-box外,还有其他重要顺式作用元件,如光响应元件、低温响应元件和胚乳表达特异性元件等。植物硒营养代谢关键酶SMT启动子的克隆及结构分析为进一步揭示SMT基因的生物学功能和表达调控机制奠定了理论基础。

超表达硒代半胱氨酸甲基转移酶基因对烟草硒酸盐胁迫的生理效应

研究了硒酸钠(Na2SeO4)对转硒代半胱氨酸甲基转移酶(SMT)基因烟草和普通烟草生长以及谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性的影响。结果表明,不同浓度硒处理转基因烟草的鲜重和株高均高于普通烟草,一定浓度范围内转基因烟草的GSH-Px活力受硒影响的程度低于普通烟草。方差分析表明,在20 mg·L-1硒处理下,转基因烟草和普通烟草的鲜重、株高差异显著,转基因烟草的鲜重和株高分别是普通烟草的1.96倍和1.80倍;在10 mg·L-1、20 mg·L-1硒处理下,普通烟草的GSH-Px活力均极显著地高于转基因烟草,前者GSH-Px活力分别是后者的1.65倍和2.48倍。显示SMT基因的转入改善了烟草对硒的耐受性。

HPLC-ESI-MS法检测香菇中甲基硒代半胱氨酸 硒代蛋氨酸 硒代半胱氨酸含量

建立一种提取和测定香菇中甲基硒代半胱氨酸(methyl selenocysteine,MeSeCys)、硒代蛋氨酸(selenom-ethionine,SeMet)、硒代半胱氨酸(selenocysteine,Sec)含量的超高效液相色谱串联质谱方法。对比3种不同前处理方法对香菇样品中硒代氨基酸的提取效果,选Agilent ZORBAX SB-AQ型亲水色谱柱(柱长100 mm,内径3.0 mm,粒径1.8μm),1%甲酸水和甲醇流动相梯度洗脱,柱温35℃,流量0.2 mL/min。结果表明,3种提取方法中,酶解提取法提取效率最高,能较好地提取香菇中甲基硒代半胱氨酸、硒代蛋氨酸、硒代半胱氨酸,采用HPLC-MS检测3种氨基酸在质量浓度0.2~20.0 ng/mL呈现较好的线性关系,平均回收率分别为92.3%,93.0%,92.4%,相对标准偏差分别为2.71%,2.14%,1.83%。该方法简单、快速、准确,适用于香菇中甲基硒代半胱氨酸、硒代蛋氨酸、硒代半胱氨酸含量的测定。

茶树ATP硫化酶和硒半胱氨酸甲基转移酶基因植物表达载体的构建

采用能有效转化双子叶植物的表达载体pBI121构建植物硒营养代谢关键酶基因的表达载体,将原载体中GUS基因用茶树ATP硫化酶基因(APS1和APS2)替换,将硒半胱氨酸甲基转移酶基因(CsSMT)连接到pBI121载体上直接与GUS基因相连,分别构建了目的基因植物表达载体pBI-APS1、pBI-APS2和pBI-CsSMT。通过三亲杂交法将重组质粒导入根癌农杆菌LBA4404中,获得转化工程菌,为通过植物基因工程获得富硒农产品打下基础。

毛薯硒代半胱氨酸甲基转移酶SMT基因的克隆与表达分析

硒代半胱氨酸甲基转移酶(SMT,Selenocysteine methyltransferase)是植物硒代谢的关键酶,在植物硒积累的过程中发挥着重要作用。为了探究毛薯中SMT基因的功能,本研究以优质富硒毛薯Ds148为研究对象,利用RT-PCR技术从中克隆到了毛薯SMT基因,命名为DsSMT。DsSMT(登录号:MH046782)包含1038 bp完整开放阅读框(ORF),预测编码345个氨基酸,理论分子量(Mw)为37.24 kD,等电点(pI)为5.01,编码的蛋白与其他植物的SMT蛋白同源性较高,具有较高的保守性。系统进化树分析显示,毛薯与海枣和菠萝的SMT蛋白的亲缘关系较近,聚为同一类。利用PSORTⅡ在线软件对DsSMT蛋白进行预测,结果表明其可能定位于细胞质中。实时荧光定量PCR分析显示,DsSMT基因在毛薯生长发育的各个时期的根、茎、叶、块茎以及块茎的皮组织中均有所表达,其中在毛薯的根和成熟期表达量最高。本研究从毛薯中克隆出了硒代谢相关酶DsSMT基因的cDNA序列,并对其进行了生物信息学分析;同时又对DsSMT基因在毛薯块茎形成的不同时期、不同组织中的表达情况进行相对定量的研究和分析,为深入研究DsSMT基因的调控机理提供分子依据,同时也为毛薯硒吸收、同化的分子机理研究奠定基础。

过表达硒代半胱氨酸甲基转移酶烟草的硒耐受特性分析

以经鉴定的硒代半胱氨酸甲基转移酶(Selenocysteine methyltransferase,SMT)转基因烟草(Nicotiana tabacum L)和野生型烟草(NC89)为材料,置于添加不同质量浓度(0、20、40和60 mg/L)硒酸钠的MS培养基上进行培养,35 d后分别测定两种处理材料的过氧化物酶活性、叶绿素、鲜质量和株高等生理生化指标.结果表明:在不同质量浓度硒酸钠处理后,SMT转基因烟草和野生型烟草的叶绿素质量分数、鲜质量及株高均较各自对照明显下降,比较而言,野生型烟草的下降幅度明显大于转基因烟草;另一方面,野生型烟草过氧化物酶(Peroxidase,POD)活性表现强烈的应激反应,其活性明显高于转基因烟草.生长生理与表型特性表明SMT转基因烟草具有一定的硒耐受性.

植物硒代谢积累及相关酶的研究进展

阐述了植物硒代谢的基本途径及其积累的分子机制,详细介绍了几种参与硒代谢的关键性酶的分子生物学特性。并展望了有关植物硒代谢的发展趋势。

L-硒甲基硒代半胱氨酸对大鼠组织硒分布及GPx-1表达的影响

目的观察给予L-硒甲基硒代半胱氨酸(L-Se-methyl selenocysteine,MSCys)对大鼠体内组织硒分布及对谷胱甘肽过氧化物酶1(glutathione peroxidase1,GPx-1)的影响。方法 60只成年大鼠雌雄各半分为空白对照组(Blank)、MSCys低剂量(10μg/kg·bw)和MSCys高剂量(25μg/kg·bw)共3组,灌胃给药。空白对照组给予等体积蒸馏水。连续给药30d(T30)后停止给药,半数大鼠安乐死后取肝、肾、肌肉组织。剩余大鼠继续饲养30d(S30),取肝肾肌肉组织。实验期间每10d采集大鼠毛发和血清。原子荧光光谱法测定血清、毛发、肝、肾和肌肉中总硒含量;ELISA法测定肝、肾和肌肉组织中的GPx-1的含量。结果实验期间,各组内雌雄大鼠各指标均差异显著(P<0.05),故雌雄大鼠均分别进行统计学分析。在给药3~4 w,高剂量MSCys组大鼠的每周体重增加量显著低于低剂量MSCys组和空白对照组(均P<0.05)。在整个实验期间各给药组的毛发和血硒含量均显著高于空白对照(Blank)组(均P<0.05),并且在多数时间点高剂量组大鼠的毛发和血硒含量均显著高于低剂量组(P<0.05)。给药30d(T30)和停药30d(S30)各剂量组大鼠肝、肾和肌肉硒含量均显著高于对照组(均P<0.05),并且在T30时,高剂量组大鼠肝、肾和肌肉硒含量均显著高于低剂量组(均P<0.05),肝和肌肉组织中的这种升高仍持续到S30(均P<0.05)。同样,在T30时各剂量组大鼠肝、肾GPx-1含量均显著高于对照组(均P<0.05),高剂量组肝脏GPx-1含量显著高于低剂量组(均P<0.05)。T30时各剂量组大鼠肝脏GPx-1含量仍显著高于对照组(均P<0.05),在雌性大鼠中高低剂量组差异显著(P<0.05)。同样高剂量组肾脏GPx-1含量显著高于低剂量组(P<0.05),并且二者均高于对照组。结论长期给大鼠灌胃L-硒甲基硒代半胱氨酸能够增加大鼠体内组织的硒含量,且能够促进机体多个组织GPx-1水平。[营养学报,2020,42(3):249-254]

印度芥菜BjSMT基因的克隆及抗硒分析

通过同源克隆技术首次克隆了硒富集模式植物印度芥菜的硒代谢关键酶(硒代半胱氨酸甲基转移酶)基因,命名为BjSMT。该基因全长1865bp,包含5个内含子序列和6个外显子序列,共编码346个氨基酸。系统发育树分析显示该基因与芸薹属甘蓝(Brassica oleracea L.)亲缘关系最近。qPCR分析发现,在低浓度硒处理下,BjSMT基因转录水平迅速提升后达到平稳,在12h达到峰值,约是对照的2.62倍。对转BjSMT烟草Na_2SeO_3胁迫研究发现,在0~240μmol/L不同Na_2SeO_3浓度胁迫下,BjSMT过表达烟草的长势明显优于转空载体烟草,在120μmol/L胁迫浓度下差异最大,株高、鲜重、谷胱甘肽过氧化物酶活性等差异最显著。表明,BjSMT可迅速增强表达响应环境硒胁迫,在植物中过表达BjSMT可显著提高其耐硒能力,为更深入研究印度芥菜富硒机理及转基因应用奠定了基础。

鄂马铃薯3号遗传转化体系的构建与表达

以鄂马铃薯(Solanum tuberosum L.)3号为试验材料,将含有来源于黄芪的硒代半胱氨酸甲基转移酶基因(AbSMT)的质粒pBinAr进行PCR扩增以及酶切连接构建重组转化子pBI121-AbSMT,运用农杆菌转化法,设置农杆菌菌液浓度梯度、侵染时间以及共培养时间组合进行遗传转化,并且通过PCR鉴定以及GUS组织化学染色进行基因表达验证。结果表明,筛选抗生素是50.00 mg/L的Kan,农杆菌菌液浓度为0.50(OD600 nm),侵染时间为8 min,共培养时间为3 d,能够实现鄂马铃薯3号高效遗传转化,同时成功构建了AbSMT基因转化的鄂马铃薯3号。

四倍体小麦Langdon HMT1基因的克隆及原核表达

硒是人类不可缺少的重要微量元素之一,人类必须补充足够的硒才能保证身体健康。同型半胱氨酸甲基转移酶(homocysteine-S-methyltransferase,HMT)基因与植物富硒关键酶硒代半胱氨酸甲基转移酶(selenocysteine methyltransferase,SMT)基因同源。为了发掘并利用麦类作物中的富硒关键酶基因,基于NCBI已公布的节节麦(Aegilops tauschii Coss.)同型半胱氨酸甲基转移酶1基因(AetHMT1)的序列设计HMT1基因的特异性引物H1-F/H1-R,克隆四倍体小麦Langdon HMT1的开放阅读框(open reading frame,ORF)后进行序列分析,并通过原核表达验证该基因。结果表明,利用H1-F/H1-R从四倍体小麦Langdon(LDN)克隆出两条长度均为975bp的序列,分别命名为LDNHMT1-1和LDNHMT1-2。LDNHMT1-1、LDNHMT1-2与AetHMT1基因一样,均编码342个氨基酸,分子量大小分别为35.19kDa和35.18kDa。通过氨基酸序列比对和进化树分析发现,LDNHMT1-1、LDNHMT1-2与其他HMT、SMT有较高的相似性。构建原核表达载体,并通过SDS-PAGE鉴定,成功获得LDNHMT1-1、LDNHMT1-2的原核表达菌株,且原核表达的蛋白质与预测分子量大小一致。