α-突触核蛋白和硝基化α-突触核蛋白在不同年龄段食蟹猴结肠中的表达

目的研究α-突触核蛋白(α-synuclein,α-syn)及硝基化α-突触核蛋白(nitratedα-synuclein,n-syn)在不同年龄段食蟹猴结肠中的表达。方法免疫组织化学方法检测α-syn和n-syn在不同年龄段食蟹猴结肠中的表达。免疫荧光双标观察α-syn和n-syn的共定位。结果α-Syn和n-syn在食蟹猴结肠中存在共定位。α-Syn和n-syn在不同年龄段食蟹猴结肠中均有表达,但α-syn和n-syn在老年食蟹猴表达量最高,在青年食蟹猴表达量最低。结论α-Syn和n-syn在食蟹猴结肠中存在共定位,且在老年猴中表达最高。

慢传输型便秘患者α-突触核蛋白硝基化的意义

目的探讨α-突触核蛋白(α-Syn)在结肠慢传输型便秘(STC)中的变化及病理学意义。方法应用免疫荧光双染技术和病理显微分析图像系统,在中倍光镜下比较22例STC患者(STC组)和20例健康志愿者(对照组)结肠黏膜α-Syn及硝基化α-Syn。结果两组结肠黏膜神经元及胶质细胞均有α-Syn及硝基化α-Syn表达。STC组结肠黏膜α-Syn及硝基化α-Syn较对照组明显增加,α-Syn黏膜层1101.1±26.34 vs.1431.3±30.36;黏膜下1023.1±31.42vs.1332.7±26.3;硝基化α-Syn(黏膜层396±14.16 vs.688.5±28.34;黏膜下129.7±3.78 vs.220.9±8.55),差异有显著性(P<0.05)。结论结肠黏膜神经α-Syn的硝基化参与STC的发病。

亚硝基化的二硫键异构酶介导甲基苯丙胺致小鼠相关脑区α-突触核蛋白表达升高

目的研究亚硝基化的二硫键异构酶(PDI)对甲基苯丙胺(METH)致小鼠海马及纹状体区α-突触核蛋白(α-SN)表达的影响。方法利用C57小鼠METH亚急性中毒模型,使用一氧化氮合酶(NOS)抑制剂N-硝基-L-精氨酸(L-NNA)与METH共同造模,实验分为对照组、L-NNA组、METH组、METH+L-NNA组。Western Blotting技术检测各组海马及纹状体区内一氧化氮合酶(NOS)、PDI及其S亚硝基化(PDI-SNO)和α-SN表达情况。一氧化氮试剂盒检测各组一氧化氮含量。结果 METH给药后NOS、一氧化氮含量、PDI-SNO、α-SN表达较对照组均明显升高(P<0.05);L-NNA与METH共处理后与METH组对比,NOS表达下降(P<0.05),一氧化氮含量明显减少(P<0.05),能够显著抑制PDI-SNO表达(P<0.05),伴随α-SN表达降低(P<0.05)。而MET H+L-NNA组、L-NNA组与对照组比较均无明显差异(P>0.05)。结论 METH作用后诱导NOS活化,一氧化氮含量升高,PDI发生显著S亚硝基化而功能失活,导致相关脑区α-SN表达升高,而NOS抑制剂L-NNA能部分缓解METH神经毒性作用。

α-突触核蛋白的异常修饰及在帕金森病中的作用机制

背景:因α-突触核蛋白异常聚集而形成的路易体是帕金森病特征性病理变化。近年多项研究揭示α-突触核蛋白聚集体的形成与其翻译后修饰关系密切。α-突触核蛋白的磷酸化、硝基化、乙酰化、泛素化等修饰在帕金森病的发病和进展中的作用得到广泛关注。目的:通过文献综述的方法阐述关于α-突触核蛋白修饰类型、修饰位点对帕金森病的特征性病理形成和进展的影响。方法:由第一作者系统检索中国知网和PubMed数据库,以“α-突触核蛋白,帕金森病,磷酸化,乙酰化,泛素化,硝基化”为中文检索词,以“α-Synuclein,Parkinson’s disease,phosphorylation,acetylation,ubiquitination,nitration”为英文检索词,收集整理近年来与α-突触核蛋白异常修饰相关的文献,最终纳入61篇文献进行综述分析。结果与结论:①α-突触核蛋白异常修饰与其蛋白结构和其带有正负电荷密切相关,其氨基端带有正电荷,易发生泛素化和乙酰化修饰;其中心疏水区域因其疏水特性易形成β片层结构,其羧基端带有负电荷,是主要磷酸化修饰区域。②磷酸化修饰位点可促进磷酸化修饰并与α-突触核蛋白的聚集密切相关,而蛋白激酶可靶向激活翻译修饰,可能有助于促进或抑制聚集体形成。③α-突触核蛋白的降解途径主要发挥清除病理性蛋白的作用,各种激酶催化促使蛋白泛素化修饰后,使其功能受损,导致蛋白异常堆积,从而加重神经退变。④α-突触核蛋白的氨基端经过乙酰化修饰后,可提升蛋白对细胞膜的穿梭能力,减缓蛋白聚集,可能为神经细胞保护靶点,但是在突变型蛋白发生乙酰化修饰后反而产生相反作用。⑤α-突触核蛋白的硝基化修饰主要与氧化应激相关,在活性氧的作用下,硝基化修饰的蛋白聚集倾向增强。⑥由于α-突触核蛋白不同翻译后修饰产生的影响各异,因此阐明其翻译后修饰的主要机制,抑制促使蛋白聚集的翻译后修饰,可能为帕金森病早期诊断和治疗提供新靶点参考。

寡聚化α-突触核蛋白在不同年龄段食蟹猴消化道中的表达

目的研究寡聚化α-突触核蛋白(oligomer-α-synuclein,oligo-α-Syn)在不同年龄段食蟹猴消化道中的表达差异。方法 Western blotting和ELISA方法检测oligo-α-Syn在不同年龄段食蟹猴消化道中的表达。结果在老年食蟹猴的食管、胃底、十二指肠、空肠、回肠和结肠中,寡聚化α-Syn浓度较青年与中年猴显著增加,且差异有统计学意义(P<0.01)。结论食蟹猴消化道的各部位中α-Syn寡聚体表达具有增龄性变化。

寡聚化和磷酸化α-突触核蛋白在不同年龄段食蟹猴脑不同部位突触小体中的表达分布

目的研究寡聚化(oligomer-α-synuclein,oligo-α-Syn)和磷酸化α-突触核蛋白(phosphorylated-α-Synuclein,p-α-Syn)在不同年龄段食蟹猴脑不同部位突触小体中的表达差异。方法酶联免疫吸附实验(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)检测oligo-α-Syn与p-α-Syn在不同年龄段食蟹猴脑不同部位突触小体中的表达。结果在老年食蟹猴的前额叶、枕叶、颞叶、海马、纹状体和丘脑中,突触小体中寡聚化与磷酸化α-Syn表达较青年与中年猴显著增加,且差异有统计学意义(P<0.01)。结论食蟹猴颞叶、海马、纹状体和丘脑突触小体中α-Syn寡聚化与磷酸化表达呈增龄性增加。

分子动力学模拟Cu2＋对α-突触核蛋白(1-17)肽段构象变化的影响

利用分子动力学模拟研究铜离子(Cu2+)对α-突触核蛋白1-17号氨基酸肽段(α-synuclein(1-17))构象变化的影响,采用GROMOS 43A1力场对Cu2+-α-synuclein(1-17)复合体和α-synuclein(1-17)肽段单体分别进行了6组独立的分子动力学模拟,每组模拟时间为500ns,总模拟时间为3μs.研究结果表明:Cu2+与α-synuclein(1-17)肽段结合使其更易向β折叠片结构折叠,促进了其二级结构的形成,增强了构象的稳定性;Cu2+增大了α-synuclein肽段疏水残基的溶剂可及表面积,增强了其疏水残基的暴露程度.自由能分析指出,Cu2+-α-synuclein(1-17)复合体的自由能比α-synuclein(1-17)肽段低,构象稳定,采样空间紧密,其自由能极小构象为β折叠片结构.构象聚类分析进一步表明,Cu2+使得α-synuclein(1-17)肽段构象趋于稳定.总之,Cu2+诱导固有无序蛋白α-synuclein(1-17)肽段由无序向有序转变,降低了构象的自由能,同时Cu2+增强了α-synuclein(1-17)肽段的疏水性,使得α-synuclein肽段因疏水作用更倾向于形成β折叠片结构,加速其疏水性聚集.

糖尿病患者血浆减少α-突触核蛋白的磷酸化和寡聚化

目的研究2型糖尿病(type 2 diabetes,T2D)患者血浆对α-突触核蛋白(α-synuclein,α-Syn)磷酸化和寡聚化聚集的影响。方法收集首都医科大学宣武医院内分泌科T2D住院患者70例,另收集年龄和性别与之匹配的健康志愿者70例作为对照组。采集抗凝血,并分离血浆。将基因重组人α-Syn在患者和对照志愿者血浆中振荡孵育,ELISA法检测各组人群血浆中寡聚化和磷酸化α-Syn形成量。结果 T2D患者血浆中寡聚化和磷酸化α-Syn形成量较对照组均有显著降低(P<0.05),且其与年龄有相关性。结论 T2D患者血浆以年龄依赖的方式减少寡聚化和磷酸化α-Syn的形成。

转突变型A53Tα-突触核蛋白基因的帕金森模型小鼠中脑的全基因组甲基化测序分析

[目的]研究帕金森氏病(PD)致病基因SNCA在A53T位置突变后对转基因小鼠中脑多巴胺,神经元DNA甲基化修饰的影响。[方法]分别取转突变的人源α-突触核蛋白(hα-syn)即hA53Tα-syn基因小鼠和对照组小鼠的中脑组织,采用重亚硫酸盐测序法(BS-seq)分别对12月龄的转基因小鼠和非转基因(nTg)小鼠进行全基因组甲基化分析,随后筛选出差异甲基化区域(D MR)用于GO富集分析。[结果]通过对比分析,我们总计发现481个DMR,其中高甲基化与低甲基化DMR分别有257和224个,包括与泛素降解途径相关的Ubqln2、HECTD4、Rnf157基因,丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶PINK1等基因。富集结果显示,差异甲基化基因总共映射到545个GO子条目,且主要富集于解剖结构发育、树突发育、神经系统发育、神经元投射等条目。[结论]帕金森致病基因SNCA在A53T位置的突变可诱导小鼠中脑多巴胺神经元DNA甲基化改变。

MPTP对小鼠中脑α-突触核蛋白线粒体表达和线粒体形态改变的影响

目的:观察MPTP对中脑黑质神经元线粒体表达α-突触核蛋白及线粒体形态改变的影响。方法:运用腹腔注射MPTP诱导C57/BL小鼠中脑黑质神经元损伤,以生理盐水腹腔注射小鼠作为对照组。运用线粒体纯化结合Western Blot分析线粒体α-突触核蛋白的水平,运用免疫组织化学标记结合激光共聚焦方法观察线粒体结构的改变。运用MPP+干预原代培养的多巴胺能神经元,观察线粒体形态的改变。结果:MPTP可以诱导小鼠中脑线粒体α-突触核蛋白的水平升高,并导致线粒体出现碎片化,碎片化的线粒体结构与α-突触核蛋白共定位。运用MPP+处理原代培养的中脑腹侧神经元,发现MPP+可以选择性地诱导多巴胺能神经元的线粒体碎片化。定量研究显示:多巴胺能神经元经MPP+处理后,线粒体的长度显著降低(P<0.01)。结论:MPTP可以在体诱导多巴胺能神经元的线粒体碎片化,线粒体α-突触核蛋白水平的升高可能与其碎片化密切相关。

家蚕丝蛋白重复片段替换人体α-突触核蛋白核心片段的研究

家蚕Bombyx mori丝丝心蛋白(silkfibroin)结晶域与人类帕金森综合症的致病蛋白α_突触核蛋白(α_synuclein,α_Syn)的积聚原理类似,都是由一段非常疏水的氨基酸组成的保守序列和一些无序卷曲,并在一定条件下发生整体的结构转换而发生纤维化所致。研究发现在这2种蛋白中存在的疏水片段是它们形成β折叠的关键。为了研究α_Syn蛋白的积聚核心在被别的积聚核心所替换后是否还可以正常纤维化,我们用PCR技术将家蚕丝丝心蛋白的核心片段替换α_Syn1-74(α_Syn74)的核心,组成一个重组蛋白α_Syn74SFX,纯化后温育6天,用ThT荧光和原子力显微镜检测该重组蛋白的结构,结果表明α_Syn74SFX未能发生纤维化。这说明具备能形成β片层的片段和无序卷曲这2个因素,并不能绝对使蛋白发生整体的结构转换。这对人工蚕丝的研究具有参考价值。

蛋白质二硫键异构酶与α-突触核蛋白的相互作用及对其聚集的影响

α-突触核蛋白(α-synuclein,αsyn)的错误折叠和聚集是帕金森症的疾病特征.分子伴侣蛋白质二硫键异构酶(PDI)可在体外结合αsyn的N端并抑制其聚集,但PDI的识别机制至今仍不明确.我们通过液体核磁共振(NMR)实验,发现人源PDI b'xa'可结合αsyn的N端区域.此外,硫黄素T(ThT)荧光实验结果表明PDI b'xa'会显著抑制αsyn的聚集.我们进一步利用NMR滴定实验确定了PDI主要通过b'结构域的疏水空腔结合αsyn.最后,我们以此构建了PDI结合αsyn的对接模型,并提出了PDI抑制αsyn聚集的作用机理.这一工作为理解PDI抑制αsyn聚集提供了实验依据.

α-synuclein硝基化修饰在帕金森病中的研究进展

帕金森病是以中脑黑质多巴胺能神经元病变和胞内路易小体形成为特征的疾病。氧化应激导致的α-synuclein蛋白硝基化修饰很可能与帕金森病发生、发展相关。本文简述了α-synuclein和硝基化α-synuclein的理化性质、结构特征,综述了近年来关于其在生理和病理条件下的作用和效应方面的研究进展,并进一步探讨了导致帕金森病发生、发展的可能机制,为防治帕金森病提供新的线索。

帕金森病相关蛋白α-Synuclein翻译后修饰的研究

帕金森病是中老年常见的神经退行性疾病,以黑质多巴胺能神经元变性缺失和路易小体形成为特征。α-Synuclein是路易小体的主要组成成分,由于它在介导帕金森病的神经毒性方面发挥很大的作用,而越来越引起人们的关注。帕金森病相关蛋白α-Synuclein存在多种翻译后修饰,可能促使路易小体形成,从而参与帕金森病的发生和发展。本文在研究α-Synuclein蛋白的磷酸化、硝基化和泛素化与帕金森病的关系的基础上进行了总结。

小鼠α-synuclein基因内含子1甲基化定量检测方法的建立及不同脑区甲基化水平的比较研究

目的建立一种定量检测小鼠α-突触核蛋白基因(α-syn)内含子1甲基化水平的方法,分析不同脑区该区域甲基化水平的差异。方法使用MSPPrimer确定小鼠α-syn内含子1的CpG岛区域。使用PyroMark assay design 2.0针对该CpG岛设计焦磷酸扩增及测序引物。采用焦磷酸测序法分析成年小鼠海马、皮质、纹状体及中脑四个脑区该区域甲基化水平。结果小鼠α-syn内含子1存在CpG岛。成功优化定量该CpG岛甲基化水平的焦磷酸测序方法。焦磷酸测序表明各脑区该区域甲基化均低于2%。结论建立了定量检测小鼠α-syn基因内含子1CpG岛甲基化水平的方法。该CpG岛甲基化对于成年小鼠各脑区中α-syn的表达不起主要调控作用。

粪便中正大麻受体相关作用蛋白1和α-突触核蛋白基因甲基化联合检测在结直肠癌诊断中应用价值

[目的]探讨粪便中正大麻受体相关作用蛋白1和α-突触核蛋白基因甲基化联合检测在结直肠癌诊断中应用价值。[方法]收集我院2014年5月~2016年5月收治的结直肠癌患者、癌前病变患者以及健康志愿者各50例的清晨粪便标本,分别作为结直肠癌组、癌前病变组和健康对照组,做好标记后,应用巢式甲基化特异性PCR(nested methylation specific PCR,nMSP)技术对3组正大麻受体相关作用蛋白1(cannabinoid receptor interacting protein 1,CNRIPl)和α-突触核蛋白(synuclein-alpha,SNCA)基因甲基化状态进行检测、比较,并对比此种诊断方案和粪便隐血(feces occult blood test,FOBT)对结直肠癌组诊断的灵敏度和特异度、诊断准确度。[结果](1)结直肠癌组DNA的CNRIPl和SNCA基因启动子甲基化率分别为74.0%和60.0%,癌前病变组分别为50.0%和40.0%,正常对照组分别为8.0%和4.0%,3组间两两比较,差异均有统计学意义(P<0.05)。(2)经病理检查确诊的结直肠癌组50患者中,经粪便中CNRIPl和SNCA基因甲基化联合检测确诊43例,灵敏度及诊断准确度均为86.0%,特异度为0;经FOBT确诊16例,灵敏度及诊断准确度均为32.0%,特异度为0。2种检查手段在直肠癌诊断中的灵敏度及诊断准确度比较,差异有统计学意义(P<0.05)。[结论]粪便中CNRIPl和SNCA基因甲基化联合检测在结直肠癌诊断中具有较高的灵敏度和准确度,可作为结直肠癌及癌前病变筛查的理想方法,安全无创,应用价值高。

百草枯引起神经元α-突触核蛋白寡聚化并向细胞核易位的时间依赖性研究

[背景]百草枯(PQ)作为散发性帕金森病(PD)的环境毒物之一可引起α-突触核蛋白(α-syn)异常聚集,但在其构象变化及亚细胞定位的研究有限。[目的]探讨PQ对多巴胺能神经元中α-syn构象以及亚细胞定位的影响。[方法]选取48只SPF级C57BL/6雄性小鼠随机分为对照组和模型组,模型组腹腔注射PQ(15 mg·kg^(-1)),对照组腹腔注射等容量0.9%生理盐水,每周注射2次,连续8周以构建类PD样小鼠模型。观察各组小鼠神经行为学(旷场实验、爬杆实验)的变化,来评估小鼠运动能力的改变。染毒结束后取小鼠脑组织进行免疫组织化学染色(IHC),检测中脑多巴胺(DA)能神经元特异性标记物酪氨酸羟化酶(TH)以及α-syn的表达量;同时采用蛋白质印迹法(WB)检测小鼠中脑TH、α-syn的蛋白表达量。以人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞作为多巴胺能神经元的体外模型,使用固定浓度PQ(100μmol·L^(-1))处理细胞不同时间(0、12、24、36、48 h)后,采用WB法分别检测全细胞、细胞质、细胞核α-syn的表达情况;酶联免疫吸附试验(ELISA)检测细胞外α-syn的表达水平;免疫荧光法(IFA)观察α-syn的位置变化。[结果]神经行为学结果显示,与对照组比较,随染毒时间的增加PQ模型组小鼠旷场周边区域停留时间增加(P<0.05),中央区域停留时间和移动距离减少(P<0.05),爬杆时间增加(P<0.05);动物实验IHC结果显示,6周、8周模型组与对照组比较,中脑TH阳性细胞数减少(P<0.05),而α-syn阳性表达量在4、6和8周增多(P<0.05);WB结果同样显示TH相对表达量在PQ染毒6、8周明显减少(P<0.05),寡聚体α-syn相对表达量在4、6和8周增多(P<0.05)。细胞实验WB结果显示,细胞全蛋白寡聚体α-syn相对表达量随时间依赖性增多(R^(2)=0.7440,P<0.05);细胞质寡聚体α-syn相对表达量随时间增加先增加后减少(P<0.05);细胞核寡聚体α-syn相对表达量随时间依赖性增加(R^(2)=0.7913,P<0.05);IFA结果显示,寡聚化的α-syn表达增加并向细胞核易位(P<0.05);ELISA结果表明,细胞所释放的α-syn随PQ染毒时间增加呈现上升的趋势(P<0.05)。[结论]PQ引起多巴胺能神经元内α-syn表达增加,结构发生寡聚化且向细胞核易位。

DNA甲基转移酶3B、γ-突触核蛋白在结直肠癌中的表达及其临床意义

目的观察DNA甲基转移酶3B（DNMT3B）、γ-突触核蛋白（SNCG）在结直肠癌组织中的表达，探讨DNMT3B、SNCG在结直肠癌组织中表达意义及其相关性。方法采用免疫组织化学染色方法检测72例结直肠癌组织及30例癌旁正常结直肠组织中DNMT3B、SNCG的表达，分析其在结直肠癌组织中的表达与临床病理参数间的关系。结果DNMT3B在结直肠癌组织中的阳性细胞表达率55．56％（40/72）明显高于正常结直肠组织黏膜的表达率23．33％（7/30），两者差异有统计学意义（P〈0．01）。DNMT3B的异常表达与结直肠癌患者年龄、性别、肿瘤大小、浸润深度无明显相关（P〉0．05），与组织分化程度、淋巴结转移及TNM分期密切相关（P〈0．01）。SNCG在结直肠癌组织中的阳性细胞表达率41．67％（30/72）明显高于正常结直肠组织黏膜的表达率6．67％（2/30），两者差异有统计学意义（P〈0．01）。SNCG的异常表达与结直肠癌患者年龄、性别、肿瘤大小、分化程度无明显相关（P〉0．05），与浸润深度、淋巴结转移及TNM分期密切相关（P〈0．05）。结直肠癌组织中DNMT3B表达与SNCG表达两者呈明显负相关（r=-0．321，P〈0．01）。结论DNMT3B和SNCG在结直肠癌组织中异常表达，参与结直肠癌的发生、发展，两者之间密切相关。

联合检测CNRIP1和SNCA甲基化在结直肠癌及其癌前病变筛查中的作用

目的:探讨粪便中正大麻受体相关作用蛋白1(cannabinoid receptor interacting protein 1,CNRIP1)和α-突触核蛋白(synuclein-alpha,SNCA)基因甲基化状态及其在结直肠癌和癌前病变中的价值。方法:收集60例结直肠癌、30例腺瘤、20例增生性息肉患者及25名健康人群的清晨粪便标本,采用甲基化特异性PCR技术分析CNRIP1和SNCA的甲基化状态。分析其与结直肠癌临床病例特征的关系,并比较两个基因甲基化单独检测或联合检测与粪便隐血(fecal occult blood test,FOBT)的诊断敏感性。结果:结直肠癌患者粪便DNA中CNRIP1和SNCA基因启动子甲基化率分别为73.3%和60.0%,腺瘤患者分别为56.7%和46.7%,增生性息肉患者分别为20.0%和15.0%,正常对照人群分别为8.0%和4.0%,结直肠癌患者和腺瘤患者无显著性差异,但与其他各组存在显著性差异(P<0.05)。2个基因甲基化状态与结直肠癌患者的临床病理指标无明显相关性。CNRIP1和SNCA的甲基化诊断结直肠癌的敏感性分别为73.3%和60.0%,联合检测的敏感性为86.7%,明显高于FOBT的33.3%,而联合检测与单独检测无明显差异。结论:粪便中CNRIP1和SNCA基因启动子甲基化水平在结直肠癌和腺瘤患者中明显升高,其联合检测有望成为结直肠癌及其腺瘤等癌前病变筛查的理想非侵入性检测方法。