小麦硝酸盐转运蛋白基因TaNRT1.1的鉴定及其等位变异分析

为解析小麦硝酸盐转运蛋白基因TaNRT1.1的生物学功能,本研究通过同源克隆的方法从普通小麦中克隆了小麦硝酸盐转运蛋白基因TaNRT1.1(TaNRT1.1-1A、TaNRT1.1-1B和TaNRT1.1-1D)。生物信息学分析表明,这三个同源基因编码的蛋白均为疏水蛋白,含有丰富的α-螺旋和无未见则卷曲,主要定位于质膜上。小麦不同组织qRT-PCR分析表明,TaNRT1.1-1A和TaNRT1.1-1B基因在根中表达量最高,其次是叶和茎,TaNRT1.1-1D基因在茎中表达量最高,其次是叶和根。因此,推测TaNRT1.1-1A和TaNRT1.1-1B基因在硝酸盐吸收过程中发挥了重要作用,TaNRT1.1-1D基因在硝酸盐转运过程中发挥了重要作用。通过对小麦TaNRT1.1基因多态性筛选发现,在TaNRT1.1-1A基因启动子上游1120 bp的位置有一个8 bp(TGCATGCA)的插入位点,该位点可能与小麦氮利用效率相关。不同氮利用效率小麦品种qRT-PCR分析结果表明,氮高效小麦品种(基因型为TaNRT1.1-1A-b)苗期根中TaNRT1.1-1A基因的相对表达量显著高于氮低效小麦品种(基因型为TaNRT1.1-1A-a)。

低氮胁迫下香蕉硝酸盐转运蛋白MaNRT2基因的克隆与表达分析

氮素是植物生长发育所必需的大量元素,也是限制植物产量的首要因素,硝酸盐转运蛋白NRT是植物吸收和利用氮素的重要蛋白。笔者以香蕉为实验材料,通过RNA-Seq测序,筛选得到一个显著差异表达的高亲和硝酸盐转运蛋白基因NRT2;通过PCR克隆获得1 509 bp的c DNA序列,生物信息学预测其编码502氨基酸,含有MFS结构域,属于NRT2基因家族,命名为MaNRT2;RNA-Seq和qRT-PCR的结果显示,MaNRT2基因的表达具有显著的组织特异性,在根中远高于叶片;低氮胁迫处理后,MaNRT2在叶片中表达量上升,在根中表达量反而下降,表明MaNRT2与香蕉氮元素的吸收转运密切相关。

节旋藻硝酸盐转运蛋白基因Amnrt P序列分析

应用生物信息学软件对获得的节旋藻硝酸盐转运蛋白基因(AmnrtP)全长序列进行了结构特征、同源性比较、多序列比对、系统发育学分析等。结果表明:该基因全长为1515个核苷酸,编码504个氨基酸,平均 GC 含量为43.8%,疏水氨基酸的比例为47.6%。该硝酸盐转运蛋白含有12个跨膜结构域(Transmembrane domains,Tm),膜拓扑结构与NRT2家族的类似,并发现了多个 NRT2家族的保守序列。同源性搜索显示与属于 NRT2基因家族的海洋蓝藻的氨基酸序列相似性为75%～89%。采用邻接法(NJ)、最大简约法(MP)和最大似然法(ML)构建了分子系统树,结果表明3种树的拓扑结构基本相似,并且在蓝藻中基于硝酸盐转运蛋白基因的系统发育关系与形态学分类结果相一致。所获 Am-nrtP 基因属于 NRT2基因家族,可成为蓝藻系统进化研究的分子标记,并为了解节旋藻中硝酸盐吸收与转运的基因结构和分子机制奠定了一定的基础。

不同形态氮肥对紫花苜蓿生长、硝酸盐转运蛋白基因MtNRT1.3表达及氮吸收的影响

为了探讨豆科牧草对不同形态氮素的吸收,以紫花苜蓿(Medicago sativa L.)为试验材料,通过盆栽试验探究不同形态氮肥对紫花苜蓿生长、硝酸盐转运蛋白基因MtNRT1.3表达和氮吸收的影响。试验设有4个处理,分别为不施氮处理(对照组,Con)、施铵态氮(NH 4 Cl—T1)、硝态氮(NaNO 3—T2)和混合氮(铵态氮、硝态氮1︰1混合—T3),各形态氮肥施加总量为按纯氮250 mg(每1 kg土)。试验结果表明,施氮处理提高了紫花苜蓿中的氮含量,施加各种氮肥均提高了紫花苜蓿根中MtNRT1.3基因的表达量,且该基因的表达量与土壤铵态氮和硝态氮呈正相关性(P<0.01)。相比于铵态氮肥,施加硝态氮肥不但可增加植株中硝态氮含量,而且能提高植株铵态氮含量;相比于单施硝态氮和铵态氮肥,混合氮肥对提高植株氮含量效果最好;施加硝态氮肥更有利于紫花苜蓿地上部分生物量的累积。因此,对紫花苜蓿施加氮肥应重视铵态氮和硝态氮的比例,增加硝态氮的比例更有利于紫花苜蓿的生长和对氮素的吸收。

矮珍珠硝酸盐转运蛋白基因GeNRT2.1的克隆和功能研究

硝酸盐转运蛋白(nitratetransporter,NRT)是植物识别、吸收和转运硝酸盐的关键蛋白,对促进作物根系发育、提高产量具有重要作用。通过筛选水生植物,利用NRT蛋白的保守区设计简并引物,并通过PCR和RACE技术,首次从矮珍珠(Glossostigmaelatinoides)中克隆得到GeNRT2.1基因。进化分析结果表明,GeNRT2.1与烟草NRT2.1在进化关系上距离最近。qRT-PCR结果表明,GeNRT2.1在矮珍珠根中表达量最高,其次是叶和茎,此外,低浓度硝酸盐(0.5 mmol·L^(−1))处理后,GeNRT2.1在根、叶、茎中的表达量分别是高浓度硝酸(2 mmol·L^(−1))处理后的1.89、1.93和2.07倍。功能互补实验发现,GeNRT2.1能使缺陷型酵母Δynr恢复生长,具有硝酸盐转运蛋白的功能。通过丰富NRT基因资源,以期为培育氮肥高效利用转基因作物,发展绿色农业,保证我国的粮食安全和环境安全提供理论依据。

青稞硝酸盐转运蛋白基因HvnNPF4.5的克隆和亚细胞定位

植物硝酸盐转运蛋白家族NPFs(Nitrate Transpoter1/Peptide Transporter Family)属于一类低亲和硝酸盐转运蛋白家族,在植物氮素吸收和转运过程中发挥着重要作用,NPFs基因家族是目前植物氮素吸收、转运和同化相关基因家族研究的热点。该研究从“昆仑14”青稞中克隆了HvnNPF4.5基因和其启动子区域序列,并对HvnNPF4.5基因和蛋白结构、系统进化和亚细胞定位进行了研究。结果表明:HvnNPF4.5基因序列含有2个内含子,启动子区域有与干旱以及脱落酸、赤霉素、生长素相关的顺式作用元件;HvnNPF4.5蛋白由614个氨基酸组成,分子量为66875.31 Da,总原子数为9465个,亲水系数为0.317,理论等电点为8.85,不稳定指数36.98,脂溶性指数为100.43,有8个磷酸化位点和12个跨膜结构,没有信号肽;HvnNPF4.5蛋白二级结构中α螺旋、延长链、β转角、无规则卷曲分别占48.83%、11.83%、3.5%、35.83%;HvnNPF4.5和其他物种的同源蛋白都有MFS结构域,将HvnNPF4.5与其他植物的氨基酸序列进行比较并构建系统进化树,发现青稞HvnNPF4.5与大麦HvNPF4.5、节节麦AtsNPF4.5的亲缘关系最近;亚细胞定位结果显示HvNPF4.5定位在细胞膜上。

谷子硝酸盐转运蛋白NRT1家族的鉴定及表达分析

[目的]为了揭示谷子硝酸盐高效吸收和利用的分子机制,本文鉴定并分析了谷子硝酸盐转运蛋白NRT1基因家族。[方法]以拟南芥中已知的11个参与硝酸盐吸收和转运的NRT1蛋白为基础,利用Blast的方法在全基因组范围内鉴定谷子参与硝酸盐吸收和转运的NRT1基因,利用MEGA7.0和MEME构建系统进化树和鉴定保守的基序,并进一步利用PlantCARE预测顺式作用元件,最后通过RT-PCR的方法研究了谷子硝酸盐转运蛋白NRT1家族基因的组织表达情况。[结果]从谷子中鉴定了8个硝酸盐转运蛋白NRT1基因,系统进化分析表明所得8个NRT1基因分别属于NPF1、NPF2、NPF4、NPF6和NPF7亚家族。谷子NRT1蛋白中都含有一个保守的QX4GX8GX3FX5P基序,可能与硝酸盐的吸收和转运相关。谷子NRT1基因的启动子中富含光响应元件,尤其是SP1元件。RT-PCR分析表明谷子8个NRT1基因表达具有组织特异性,暗示了其可能在不同组织和器官的硝酸盐吸收转运中起作用。[结论]本研究鉴定了8个谷子硝酸盐吸收和转运相关的NRT1基因,为后续谷子NRT1基因功能研究及谷子耐低氮分子机制的揭示奠定了基础。

高粱高亲和硝酸盐转运蛋白NRT2/3基因家族鉴定、表达与DNA变异分析

硝态氮是作物吸收无机氮素的主要形态,硝酸盐转运蛋白2(nitrate transporter 2,NRT2)作为高亲和性的转运蛋白,以硝酸盐作为特异性底物,在可利用的硝酸盐受限时,高亲和性转运系统被激活,在硝酸盐吸收、转运过程中发挥着重要作用。大多数NRT2不能单独转运硝酸盐,需在硝酸盐同化相关蛋白2(nitrate assimilation related protein 2,NAR2)的协助下才能完成硝酸盐的吸收或转运。作物氮利用效率受环境条件影响,品种间存在差异,因此培育高氮素利用效率品种有重大意义。高粱(Sorghum bicolor)具有耐贫瘠特性,对土壤中的氮素吸收和利用效率较高。本研究结合高粱基因组数据库对NRT2/3基因家族成员基因结构、染色体定位、理化性质、二级结构与跨膜结构域、信号肽与亚细胞定位、启动子区顺式作用元件、系统进化、单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)的识别与注释及选择压力进行了全面分析。通过生物信息学分析,筛选出5个NRT2s(命名为SbNRT2-1a、2-1b、SbNRT2-2–4)基因和2个NAR2s(SbNRT3-1–2)基因,较谷子略少。分布在3条染色体上,分为4个亚家族,同一亚族中基因结构高度相似;高粱NRT2/3亲水性平均值均为正值,表明均为疏水性蛋白;α-螺旋和无规则卷曲占二级结构总量的比例大于70%;亚细胞定位均在质膜上,其中NRT2s蛋白不含信号肽,NRT3s蛋白含信号肽;进一步对其跨膜结构域进行分析,发现NRT2s家族成员跨膜结构域个数均大于10个,而NRT3s家族成员跨膜结构域个数为2个;高粱与玉米(Zea mays)NRT2/3s的共线性较好;蛋白结构域显示存在MFS_1和NAR2蛋白结构域,可执行高亲和力硝酸盐转运;系统进化树分析可知,高粱与玉米和谷子的NRT2/3基因亲缘关系更近;基因启动子顺式作用元件分析发现,SbNRT2/3基因的启动子区均具有数个植物激素和逆境应答元件,可以响应高粱生长和环境变化;基因表达热图显示低氮条件下在根诱导表达的是SbNRT2-1a、SbNRT2-1b和SbNRT3-1,推测可在高粱根部表达并调控对硝酸盐的吸收或转运过程。在SbNRT2-4和SbNRT2-1a等发现多个非同义SNP变异;选择压力分析表明,高粱NRT2/3基因家族在进化过程中受纯化选择作用。SbNRT2/3基因表达及蚜虫侵染影响与基因在不同组织中的表达分析结果一致,SbNRT2-1b和SbNRT3-1在感染蚜虫品系5-27sug根部表达显著,高粱蚜虫侵染叶片显著降低了SbNRT2-3、SbNRT2-4和SbNRT3-2的表达水平。本研究初步对高粱全基因组NRT2/3基因家族进行鉴定、表达与DNA变异分析,为高粱氮高效研究提供了基础。

不同小白菜品种硝酸盐含量、氮代谢关键酶活性及NRT1表达和亚细胞定位

采用液体培养实验研究了不同硝铵比(NO_3^-∶c(NH_4^+)分别为50∶50、75∶25和100∶0)对低硝酸盐富集品种‘香港特选奶白菜’和高硝酸盐富集品种‘揭农四号春白菜’硝酸盐含量、氮代谢关键酶活性的影响,并探讨了两个品种小白菜硝酸盐转运蛋白基因的表达和亚细胞定位。结果表明:‘香港特选奶白菜’和‘揭农四号春白菜’在硝铵比100∶0处理中,叶硝酸盐含量分别较硝铵比50∶50处理增加了13.2%和30.4%,叶柄硝酸盐含量增加了14.3%和4.9%。随着硝铵比的增加,小白菜叶片硝酸还原酶、谷氨酸合成酶活力呈降低趋势,亚硝酸还原酶活力呈上升趋势,谷氨酸脱氢酶活力呈先增加后降低趋势,且两个小白菜品种之间差异显著。低亲和硝酸盐转运蛋白(nitrate transporter,NRT)1基因NRT1在两个小白菜品种中均显著表达,且高富集硝酸盐品种"揭农四号春白菜"的表达量显著高于低富集硝酸盐品种‘香港特选奶白菜’的表达量。NRT1是一个定位于细胞膜上的低亲和NRT。

武运粳7号超表达OsNRT1.2后对硝酸盐的响应

应用公开的植物基因组数据库和生物信息学分析确定了一个水稻低亲和硝酸盐运输蛋白候选基因OsNRT1.2。利用农杆菌介导Ubiquitin启动子过量表达OsNRT1.2,研究了该基因在武运粳7号中的获得性功能特征。OsNRT1.2的cD-NA序列从KOME网站中获得,该序列全长为2178bp,编码阅读框为1732bp,编码533个氨基酸。采用半定量RT-PCR技术分析,OsNRT1.2在武运粳7号中表达存在器官特异性,主要在根系表达,地上部分几乎不表达。通过将pUbi-OsNRT1.2在武运粳7号中转化,得到OsNRT1.2基因超量表达材料。0.2mmol/L NO3-和5.0mmol/L NO3-处理野生型(WT)和T2转基因植株OE1、OE2和OE8 30d,每10d跟踪记录株高和根长。转基因植株(除OE8在5.0mmol/L NO3-供氮水平外)与WT株高无明显差异,根长增加量显著降低。在0.2mmol/L NO3-供氮水平下,转基因植株和WT地上部分和根系的全氮含量均无显著差异;在5.0mmol/L NO3-供氮水平下,除OE1外,OE2和OE8地上部分全氮含量显著增加,3个转基因株系比WT根系全氮含量显著降低。在两个氮素水平处理条件下,转基因植株根冠比都显著降低;生物量比WT都增加,在0.2mmol/L NO3-供氮水平下增加了9.4%～31.1%,在5.0mmol/L NO3-供氮水平下增加了12.5%～43.8%。研究表明,OsNRT1.2基因在武运粳7号中可能参与了氮素从根系向地上部的转运,从而导致地上部生物量增加。

盐胁迫对花生硝酸盐积累及信号转导的影响

为探索盐胁迫对花生硝酸盐积累的影响,本研究测定了盐处理花生叶片的硝酸盐含量,发现盐胁迫抑制硝酸盐的积累。进一步对花生地下部和地上部样品进行RNA-seq分析,发现13个花生中响应盐胁迫的硝酸盐吸收、转运以及信号转导的相关基因。本研究揭示了盐胁迫影响花生硝酸盐积累的可能机制,为进一步研究提供了目标基因。

硝酸盐转运蛋白NRT2在植物中的功能及分子机制研究进展

氮素作为植物生长发育所需的大量元素,对植物生长发育及作物产量具有重要作用。施入氮肥是植物及作物的主要氮素来源。面对当下过度施肥造成面源污染加剧的现状,提高作物氮素利用效率,实现“减肥增产”的绿色增产增效模式,是促进我国农业可持续发展及保障国家粮食安全的重要措施。当土壤氮匮缺时,硝酸盐转运蛋白NRT2家族成员对根系吸收及转运硝酸盐至关重要,其中NRT2.1在植物缺氮时主要负责根部的硝酸根吸收。该文重点总结了模式植物拟南芥(Arabidopsis thaliana)及重要粮油作物中NRT2家族蛋白特别是NRT2.1的功能及调控机理研究进展,旨在为后续挖掘NRT2在提高作物产量方面的潜力及分子调控机制研究提供重要依据。

茶树硝酸盐转运蛋白基因的克隆和表达分析

硝酸盐转运蛋白(NRT)是植物吸收和利用硝态氮的一种关键蛋白。运用RACE技术从茶树中扩增出NRT基因的cDNA,并利用实时荧光定量PCR检测了CsNRT基因在不同茶树器官与品种之间的差异表达。结果表明:CsNRT基因的cDNA全长2 061 bp,开放阅读框为1 818 bp,编码含由605个氨基酸组成的蛋白质,GenBank登录号为KJ160503,属于NRT2基因家族。CsNRT为组成型基因,对不同处理的水培茶苗进行定量表达分析显示,该基因在根、茎、叶中都有表达,其中在根部的表达水平最高,1.0 mmol·L-1的NO3-可诱导其表达量上升7.53倍。不同茶树品种中CsNRT基因的表达也有较大差异,‘龙井长叶’和‘凫早2号’的表达量较高,前者强烈响应0.5和1.0 mmol·L-1 NO3-的诱导,后者的响应浓度为1.0和2.0mmol·L-1,而‘舒茶早’在各浓度下的表达差异不明显。

外源氮素形态对苜蓿硝酸盐转运蛋白基因NRT1.3表达的影响

为探究添加不同形态氮素对紫花苜蓿幼根中硝酸盐转运蛋白基因NRT1.3表达的影响,试验设置4个处理,分别为对照（不加氮）、添加硝态氮、添加铵态氮和添加混合态氮,在紫花苜蓿分枝期测定了添加不同形态氮素后紫花苜蓿幼根中硝酸盐转运蛋白基因NRT1.3表达量的差异以及苜蓿生理指标、土壤氮含量对该基因表达的影响。结果表明：紫花苜蓿根中硝酸盐转运蛋白基因NRT1.3的表达量随着氮素的添加而显著增加（P〈0.05）,在添加混合态氮的处理中达到最高;土壤全氮、硝态氮和铵态氮浓度随氮素添加而显著升高（P〈0.05）,紫花苜蓿根中硝酸盐转运蛋白基因NRT1.3的表达量与土壤氮素浓度呈显著正相关关系（P〈0.05）。此外,试验结果也表明NRT1.3基因的表达与紫花苜蓿的株高、鲜重及叶绿素、硝酸盐含量也呈显著正相关关系（P〈0.05）。

农杆菌介导的氮高效利用转基因水稻植株的获得

将从深海硅藻中克隆的与氮具有高度亲和性的硝酸盐转运蛋白基因NAT3通过农杆菌介导的遗传转化方法,转入水稻品种中花11,在含30 mg/L Basta的选择培养基上筛选,获得456棵抗性植株,对NAT3目标基因检测,获得313棵阳性植株,初步证明目标基因已整合到中花11基因组中。

转NAT3基因水稻氮素利用效率分析

对海洋硅藻硝酸盐转运蛋白NAT3编码基因的单拷贝插入转基因水稻纯系进行荧光定量PCR检测,获得NAT3基因的超表达株系。NAT3超表达株系中硝酸还原酶基因Os NR1的转录较非转基因对照中花11显著增强。对超表达株系及对照中花11进行不同氮素浓度的培养和栽培试验。结果表明,在低氮培养基培养条件下,转NAT3基因水稻的幼苗干重较中花11高;在低氮盆栽条件下,转NAT3基因超表达株系的叶绿素含量、生物学产量和植株的含氮量均较相同氮素条件下的中花11高,说明NAT3基因超表达能提高转基因水稻在低氮条件下的氮素利用效率,促进水稻生长。

番茄SlNRT2基因家族鉴定、启动子克隆及表达分析

硝酸盐转运蛋白2(Nitrate transporter 2,NRT2),是一种高亲和硝酸盐转运蛋白,在植物对硝酸盐的吸收和转运过程中发挥重要作用。本研究通过生物信息学方法对番茄(Solanum lycopersicum)NRT2(SlNRT2)家族基因进行鉴定,利用热图分析SlNRT2家族成员基因表达模式,并利用启动子嵌合GUS报告基因转化拟南芥对SlNRT2启动子活性进行分析。结果表明番茄基因组中鉴定到5个NRT2基因,定位于细胞膜,氨基酸序列长度介于458~531 aa,等电点介于9.05~9.33,不稳定性指数介于31.84~40.70。基因结构分析表明,该基因家族由3~4个外显子构成。染色体定位分析显示,SlNRT2基因分布于3条染色体上。系统进化和保守结构域分析显示,SlNRT2分别归属于I和II两个类群,具有10种保守基序,蛋白保守性很高。番茄不同组织热图分析表明SlNRT2.1和SlNRT2.2呈组成型表达;SlNRT2.3~SlNRT2.5主要在根部表达。启动子顺式作用元件及GUS组织化学染色分析结果表明,SlNRT2.4启动子驱动GUS基因在拟南芥根部特异性表达,而SlNRT2.3和SlNRT2.5除驱动GUS基因在拟南芥根部表达,叶片也有表达。本研究为后续开展SlNRT2基因的功能研究提供依据,同时为培育氮素高效利用型转基因番茄奠定了基础。

高氮与低氮处理对不同氮效率小麦根系及相关生理特性的影响

提高氮素利用效率是促进农业可持续发展的重要举措之一。为研究高、低氮条件下不同氮效率小麦的根系特征及其生理特性,以3个高效吸收利用氮素(氮高效)小麦品种与3个低效吸收利用氮素(氮低效)小麦品种为试验材料,分析了水培条件下高氮和低氮处理对小麦根系特征和硝酸盐转运蛋白基因表达水平的影响;并分析了大田条件下高氮和低氮处理对不同时期小麦氮代谢关键酶(硝酸还原酶、谷氨酰胺合成酶)活性和氮素积累量的影响。结果表明,在高氮和低氮处理下,氮高效品种的根尖数、根长、根体积、根表面积和根活力均显著高于氮低效品种。氮高效品种的6个硝酸盐转运蛋白基因(TaNRT2.1、TaNRT2.2、TaNRT2.3、TaNAR2.1、TaNAR2.2和TaNAR2.3)的平均相对表达量均显著高于氮低效品种。高氮和低氮处理下,不同时期氮高效品种的硝酸还原酶和谷氨酰胺合成酶活性以及氮素积累量均显著高于氮低效品种;与高氮处理相比,低氮处理下氮高效品种和氮低效品种的硝酸还原酶和谷氨酰胺合成酶活性以及氮素积累量均有所降低,其中氮低效品种降低幅度较高。这说明不同氮效率材料在根系相关性状、硝酸盐转运、氮代谢关键酶活性以及氮素积累量存在显著的基因型差异。综上所述,在低氮条件下,小麦根系形态、根系活力、硝酸转运蛋白相关基因和氮代谢关键酶活性对氮素吸收具有重要的调控作用,其综合改良可为氮高效小麦品种的选育提供帮助。

甘薯NRT基因家族成员鉴定及其在不同氮素条件下的表达模式分析

硝酸盐转运蛋白NRTs参与植物对硝态氮的吸收、转运,促进植物生长。为探究甘薯响应硝态氮供应的机制及其硝酸盐转运蛋白IbNRT基因家族的功能,本研究测定菜用甘薯在不同NO_(3)^(-)-N条件下硝酸还原酶、谷氨酰胺合成酶活性的动态变化,并利用生物信息学方法鉴定出76个IbNRT家族成员,分析其基因结构、进化关系、保守基序、顺式作用元件以及低氮胁迫下的基因表达模式。结果显示:低氮胁迫降低菜用甘薯酶活性,各处理在胁迫2 d后达显著差异。甘薯IbNRT家族分为IbNRT1、IbNRT2、IbNRT3三个亚族,定位在细胞膜上,分布在13条染色体上,均含特定的保守结构域,启动子区含多种类型的顺式作用元件。IbNRT家族亚家族内蛋白序列保守性较强,但亚家族间差异显著。RT-qPCR结果显示,IbNRT基因表达受营养液NO_(3)^(-)-N浓度的影响,表明IbNRT基因家族参与甘薯对氮素的响应过程,该研究结果可为进一步甘薯硝酸盐转运蛋白IbNRT家族基因的克隆及功能研究提供一定的参考。