硝酸纤维素膜印迹法测定对虾微量血淋巴碱性磷酸酶相对活性

用硝酸纤维素膜(NCM)印迹法测定日本对虾(Penaeusjaponicus)血淋巴碱性磷酸酶(ALP)的相对活性,以标准ALP梯度稀释液为参照,比较NCM印迹法与ALP测定试剂盒法对标准ALP梯度液的测定结果。数据回归分析显示,NCM印迹法所得结果同标准ALP梯度稀释液活性的回归关系极显著(P<0.01);用NCM印迹法测定ALP相对活性的灵敏度为试剂盒的100倍。分别用NCM印迹法与ALP测定试剂盒测定对虾血淋巴的ALP相对活性,测得结果呈强直线相关性(P<0.01),说明用NCM印迹法测定对虾血淋巴ALP相对活性具可行性。

酶联免疫吸附反应的技术进展及应用

以常规的酶联免疫吸附法为基础,不断改进,形成了多种酶联免疫吸附法,如模块化ELISA,双位点一步法,捕获法测IgM抗体,生物素、亲和素系统,斑点酶链免疫吸附试验,硝酸纤维素膜微粒ELISA等方法。酶链免疫吸附法在医药,食品加工业,农牧渔业等领域有着广泛的应用:如乙型肝炎,莱姆病,急性心肌梗死的早期诊断,定量检测内毒素,HIV抗体初筛,SARS病毒的快速检测;检测食品中的毒素,残留农药,微生物及其它成分;检测香蕉有关病毒,小麦黄花叶病毒,棉花黄萎病菌毒素,转Bt基因抗 虫棉,检测水产品中氯霉素的残留量,猪细小病毒(PPV)血清抗体,禽脑脊髓抗体等。

中国利用异源竞争性抗原提高原料乳中恩诺沙星的酶联免疫吸附测定灵敏度

利用异源竞争策略已成为提高酶联免疫吸附测定(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)法检测灵敏度的重要手段。中国研究人员以抗恩诺沙星(antienrofloxacin,ENR)-牛血清白蛋白(bovine serum albumin,BSA)为免疫原,制备ENR单克隆抗体,然后利用喹诺酮类物质的分子描述符筛选异源性包膜抗原,用于ENR的检测,基于集成学习方法,提高ELISA实验的检测灵敏度。结果表明:7种外源竞争抗原中有6种能提高ELISA实验的灵敏度;与ENR-BSA作为同源包被抗原相比,以抗沙拉沙星-BSA作为异源包被抗原时的检测灵敏度提高10倍(PBS中)和6倍(牛乳中)。

转Bt抗虫基因植物中杀虫蛋白的酶联免疫检测技术研究 Ⅲ.酶联免疫(ELISA)间接法检测Bt杀虫蛋白研究

采用ELISA间接检测法,研究了2种酶标羊抗兔抗体(辣根过氧化物酶与碱性磷酸酶)和2种检测载体(聚苯乙烯多孔板和硝酸纤维膜)对检测灵敏度和样本检测效果的影响.结果表明,在采用纯的杀虫晶体蛋白进行灵敏度检测时,2种酶标抗体的测定结果非常相近,无明显差别,灵敏度可达7.8～15.6 ng.但在检测植物样本时,不同酶标抗体则存在差异.表现为碱性磷酸酶标记的抗体优于辣根过氧化物酶标记的抗体.这主要是由于植物样本中有内源过氧化物酶所致.用硝酸纤维素膜和聚苯乙烯多孔板作载体进行检测纯的Bt杀虫蛋白的效果二者相当.但检测植物样本时,植物中的叶绿素对Dot-ELISA的干扰很大,准确性差.本研究所制备的Bt杀虫蛋白抗体具有高的特异性.

磁珠分离酶联免疫法在检测血清β-HCG中的应用

目的提高磁珠分离酶联免疫定量测定法在检测血清β-HCG中的临床应用价值。方法为酶联免疫分析系统与磁性微粒分离技术相结合的一种测定法,使用两种高亲合力单克隆抗体,不用离心机离心在磁场中沉淀,然后用光度计测量所形成颜色强度。结果磁珠分离酶联免疫法中酶反应生成的颜色强度在测定工作范围内与患者标本中β-HCG浓度成正比。结论磁珠分离酶联免疫法定量检测血清β-HCG有很高的灵敏度和准确度。

登革病毒包膜蛋白Ⅲ区IgG抗体捕获酶联免疫吸附试验的建立及应用

【摘要】目的建立一种高度敏感和特异的登革病毒（denguevirus，DENV）包膜蛋白Ⅲ区（envelopeproteindomain1]I，EDm）IgG抗体的检测方法，并探索这种方法在登革热诊断和血清流行病学调查中的应用价值。方法以毕赤酵母表达系统制备的重组全长DENVEDm作为抗原，建立DENVEDmIgG抗体捕获ELISA。用这种方法检测来自同一组35例DENV一1初次感染患者在2006年发病期和2010年随访期的血清标本，并将其检测的敏感性与商品化的PanbioDENVIgG抗体捕获ELISA试剂盒进行对比。结果DENVEDHIIgGELISA试剂盒对发病期和随访期血清标本检测的灵敏度分别是87％（20／23）和94％（33／35），而Panbio DENV IgGELISA试剂盒对这两个时期血清标本检测的灵敏度分别是71％（25／35）和0。DENV EDⅢ IgG ELISA试剂盒对两个时期血清检测灵敏度差异无统计学意义（X^2=0．946，P=0．331）。对于发病期血清标本，DENVEDⅢIgG ELISA试剂盒与Panbio DENV IgG ELISA试剂盒检测的灵敏度比较，差异无统计学意义（X^2=1．924，P=0．165）；而对随访期血清标本，DENV EDⅢ IgG ELISA试剂盒检测灵敏度高于Panbio DENV IgG ELISA试剂盒，差异有统计学意义（X^2=62．432，P=0．000）。结论DENVEDⅢIgG抗体捕获ELISA试剂盒对登革热患者发病期血清及随访期血清中IgG抗体的检测均具有高度的敏感性，有可能成为DF诊断和血清流行病学调查的有效工具。

非结构蛋白1抗原捕获酶联免疫吸附法评价登革病毒抗体中和活性

目的在获得具有中和活性的针对Ⅰ型登革病毒（dengue virus serotype Ⅰ，DENV-1）的抗体基础上，评价已建立的非结构蛋白Ⅰ（nonstructural protein 1，NS1）抗原捕获酶联免疫吸附法（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）分析抗体中和活性的可行性，为中和抗体的筛选和疫苗效果的评价提供一个更为快速、简便的检测方法。方法使用重组DENV-1包膜蛋白Ⅲ区（envelope protein domain Ⅲ，EDⅢ）免疫5只BALB／c小鼠制备单克隆抗体（简称单抗），采用间接ELISA、间接免疫荧光法（immunofluorescence assay，IFA）和免疫印迹法（Western Blot）对单抗进行筛选及鉴定；同时用该重组蛋白免疫1只新西兰兔，制备多克隆抗体血清；以传统噬斑减少中和试验（plaque reduction neutralization test，PRNT）作为参比方法，采用NS1抗原捕获ELISA对所获抗体进行中和活性检测。结果获得4株针对DENV-1 EDⅢ单抗和1份兔多抗血清，且被PRNT试验证明均具有中和活性，四株单抗腹水（1A1、1B3、3D3、9D6）和兔多抗血清中和效价分别为1：1024、1：512、1：256、1：4096和1：4096。使用NS1抗原捕获EHSA法检测不到PRNT中和效价最低的3D3抗体对DENV-1有中和能力，而检测其余3株单抗（1A1、1B3、9D6）和多抗兔血清中和效价均远低于PRNT测定结果，分别为1：32、1：32、1：128和1：128。结论简单、快速的NS1抗原捕获ELISA可用于评价DENV抗体的中和活性，该方法适合于高效价中和抗体的筛选，有望成为评价疫苗效果的方法之一。

血管紧张素Ⅱ调控基质金属蛋白酶9的表达在蛛网膜下腔出血发病中的机制研究

目的探讨血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)调控基质金属蛋白酶9(MMP⁃9)的表达在蛛网膜下腔出血(SAH)发病中的机制。方法人脑微血管内皮细胞(HBMEC)株分为AngⅡ组、AngⅡ+SB203580组和对照组。其中AngⅡ组以100μg/L浓度AngⅡ处理90 min、2 h、4 h、6 h、12 h后取细胞上清液进行相关指标检测;AngⅡ+SB203580组以5μΜ的SB203580处理20 min后以100μg/L浓度AngⅡ处理90 min、2 h、4 h、6 h、12 h后取细胞上清液进行相关指标检测;对照组加入RPMI⁃1640培养液培养90 min、2 h、4 h、6 h、12 h后取细胞上清液进行相关指标检测。以酶联免疫吸附法(ELISA)检测各组细胞上清液MMP⁃9水平,并以实时荧光定量PCR和蛋白质印迹法检测各组细胞p38丝裂原活化蛋白激酶(p38 MAPK)的mRNA和蛋白表达水平。结果与对照组比较,AngⅡ组细胞上清液MMP⁃9[处理12 h:(4.21±1.36)μg/L比(5.81±1.72)μg/L,P<0.01]水平升高,AngⅡ+SB203580组细胞上清液MMP⁃9[处理12 h:(4.21±1.36)μg/L比(3.64±1.45)μg/L,P<0.01]水平降低(P<0.05)。与AngⅡ组比较,AngⅡ+SB203580组细胞上清液MMP⁃9水平降低(P<0.001)。与对照组比较,AngⅡ组细胞p38 MAPK的mRNA[处理12 h:(0.422±0.057)比(0.538±0.071),P<0.05)]和蛋白表达水平[(0.452±0.105)比(0.635±0.133),P<0.001]升高,AngⅡ+SB203580组细胞p38 MAPK的mRNA[处理12 h:(0.422±0.057)比(0.375±0.066),P<0.05]和蛋白表达水平[(0.452±0.105)比(0.276±0.081),P<0.001]降低(P<0.05)。与AngⅡ组比较,AngⅡ+SB203580组细胞p38 MAPK的mRNA和蛋白表达水平降低(P<0.001)。结论AngⅡ可能通过激活p38 MAPK信号通路上调MMP⁃9表达从而促进SAH发生发展。

颅内动脉瘤性蛛网膜下腔出血患者血清血管生成素-1/-2的表达

颅内动脉瘤（intracranial aneurysms,ICA）是在各种因素的影响下,发生在颅内动脉壁的囊性突起,是引起蛛网膜下腔出血（subarachnoid hemorrhage,SAH）的主要原因之一[1]。ICA的形成机制尚不十分明确,可能与脑血管壁损伤-修复的平衡受到破坏有关。

抗1型血小板反应蛋白7A抗体与特发性膜性肾病的关系

目的探讨抗1型血小板反应蛋白7A(Thrombospondin type 1 domain-containing 7A,THSD7A)抗体对特发性膜性肾病的诊断和疾病活动监测价值。方法本研究收集了经肾活检并确诊的IMN 127例,并以同期50例非IMN肾脏疾病为对照,采用半定量WB检测被试者血清中抗THSD7A抗体,采用定量ELISA(Enzyme-linked immunosorbent assay)检测被试者血清中抗THSD7A抗体滴度。回顾性分析临床资料。结果利用WB方法,血清中抗THSD7A抗体在IMN中阳性率为7.1%;利用ELISA方法,血清中抗THSD7A抗体在IMN中阳性率为7.9%;抗体滴度水平越高,则低白蛋白血症越严重(P<0.05),24 h尿蛋白定量值越大(P<0.05);e GFR下降越明显(P<0.05)。WB和ELISA两种方法的抗体检出率比较差异无统计学意义(P=0.5)。结论 IMN中抗THSD7A抗体的检出率不高,该抗体对IMN诊断具有较高的特异性,诊断准确性良好。抗THSD7A抗体可反映IMN的活动性。

硫代葡萄糖甙测定方法的新进展

对近来新开发的硫代葡萄糖甙分析方法进行了介绍,包括膜在测定硫甙方面的应用、对硫甙酶解产物的测定、酶联免疫吸附测定硫甙、使用硫甙的碱降解产物测定硫甙、色质联用分离鉴定硫甙、离子对液相色谱和亲水作用液相色谱的应用等,并对各种测定方法进行了比较与总结。

高浓度硝酸甘油对肿瘤细胞MMP-9/TIMP-1表达的调控

利用基因芯片、RT-PCR技术和ELISA方法观察硝酸甘油(GTN)作为一氧化氮供体对人宫颈癌细胞(Hela)MMP-9/TIMP-1基因及蛋白表达的调控。通过基因芯片对肿瘤转移相关基因的表达进行筛选,应用RT-PCR技术对MMP-9/TIMP-1基因表达进行观察,ELISA方法测定细胞培养液中MMP-9/TIMP-1蛋白浓度并计算二者比值。结果显示,培养液GTN浓度为40μg/mL时,细胞中多个肿瘤相关基因表达改变;实验组与对照组比较,细胞MMP-9基因表达有大幅度下降,TIMP-1基因表达改变不明显;实验组细胞培养液MMP-9蛋白浓度也出现明显降低,TIMP-1无显著改变,MMP-9/TIMP-1比值变化显著。结论:硝酸甘油在一定浓度下能够调控肿瘤细胞的基因表达并改变MMP-9/TIMP-1的动态平衡。

深圳市健康人群2005-2006年A、C、Y和W135群流脑抗体水平的测定

目的 了解2005—2006年深圳市健康人群A、C、Y和W135群流脑抗体水平，为制定有效的预防控制措施提供依据。方法 2005年11月至2006年5月采集深圳市健康人群血液样本，采用酶联免疫试剂盒定量测定血清样本中A、C、Y、W135群流脑抗体含量。结果 共采集800份血液样本，A、C、Y、W135群流脑抗体平均含量中位数分别是4．07、2．31、1．35和1．75ug／mL，抗体阳性率分别为68.4％、57．1％、32．4％和41．8％。A群抗体含量中位数较高的年龄组是5～9岁（6．19ug／mL）、15～24岁（5．52ug／mL）和0～4岁（5．32ug／mL），较低的是≥45岁（2．68ug/mL）和35～44岁（2．01ug／mL）；C群抗体含量中位数较高的是0～4岁（3．70ug／mL）、10～14岁（3．34ug／mL），较低的是15～24岁（1．84ug／mL）；Y群抗体含量中位数除5～9组（0．55ug／mL）较低外，其他均在1．21～1．68ug／mL之间；W135群抗体含量中位数在1．34～2．01ug／mL之间。结论 深圳市35岁以上健康人群的A群流脑抗体水平以及各年龄段Y群和W135群流脑抗体水平均较低。

血清游离人绒毛膜促性腺激素β亚基检测及临床应用

人绒毛膜促性腺激素（human chorionic gonadotropin，HCG）是由胎盘合体滋养细胞所分泌的、由α和β亚基通过非共价键组成的糖蛋白激素，相对分子质量为37．5×10^3。除整分子HCG外，可在血浆、血清和尿中检测到HCG的亚基（游离α、β亚基）和游离亚基的降解产物。

猪瘟快速监控技术在猪瘟免疫中的应用

1猪口蹄疫快速检测卡简介 1.1监测卡的原理 检测卡利用抗体快速金标检测卡法（简称金标法）检测抗体效价。金标法是在酶联免疫吸附法的基础上发展起来的一种固相标记免疫测定新技术。其检测原理是,以微孔滤膜为载体,包被已知抗原,加入待检标本后,经滤膜的毛细管作用,标本中的抗体与胶体金结合的抗原相结合,再通过与膜上包被的抗原结合显色而达到检测目的。

斑点法膜型快速检测HBsAg

斑点法膜型快速检测ＨＢｓＡｇ贾建成，郑胜香，杨筱，王沈馨（宁夏自治区医院检验科，银川７５００２１）目前检验乙肝表面抗原（ＨＢｓＡｇ）的方法有反向间接血凝法（ＲＰＨＡ），酶联免疫吸附法（ＥＬＩＳＡ），放免法（ＲＩＡ），以上诸法有的灵敏度低，常出现非特异...

缺氧状态下人颞下颌关节滑膜成纤维细胞环氧合酶2的表达及意义

目的研究缺氧对人颞下颌关节滑膜成纤维细胞环氧合酶2(COX2)表达的影响,并探讨其在颞下颌关节紊乱病(TMD)中的生物学作用。方法应用逆转录聚合酶链反应(RTPCR)和Western印迹检测缺氧不同时间段滑膜成纤维细胞COX2基因与蛋白质表达水平。采用酶联免疫吸附实验(ELISA)以及明胶酶谱法分别测定缺氧组、缺氧与COX2特异性抑制剂塞来昔布二者联合作用组前列腺素E2(PGE2),金属基质蛋白酶2、9(MMP2、MMP9)分泌量的变化,以常氧组为对照。结果(1)RTPCR测定细胞缺氧4、8hCOX2mRNA分别为1.51±0.34和1.39±0.57,与常氧组0.65±0.24和0.71±0.15比较,差异有统计学意义(均P<0.05)。(2)Western印迹测定细胞COX2蛋白表达,缺氧6h为0.29±0.06,12h为0.51±0.09,24h为0.68±0.11,而常氧组检测不出COX2蛋白(均P<0.01),表明缺氧条件下,细胞COX2蛋白表达呈时间依赖性增加。(3)ELISA测定细胞缺氧12h,释放的PGE2(7.6ng/ml±0.8ng/ml)显著高于常氧组(2.5ng/ml±0.4ng/ml,P<0.01);联合药物处理组(4.3ng/ml±0.4ng/ml)也显著低于缺氧组(P<0.05),表明细胞PGE2释放受抑制。(4)明胶酶谱法测定细胞缺氧12h,分泌的MMP2、MMP9高于常氧组,但在药物联合作用下,分泌能力减弱。结论组织缺氧是导致TMD的一个重要因素;缺氧状况下,人滑膜成纤维细胞可能通过增加COX2的表达来影响缺氧所致颞下颌关节病变进程。

烟粉虱中甘薯褪绿矮化病毒(SPCSV)的快速检测技术

建立了利用NCM-ELISA、RT-PCR和半巢式RT-PCR检测烟粉虱中SPCSV的方法,比较了3种检测方法的灵敏性。结果表明,NCM-ELISA最低能从16头带毒烟粉虱中检测出SPCSV;RT-PCR能稳定地从3头以上带毒烟粉虱中检测出SPCSV;半巢式RT-PCR能稳定地从单头烟粉虱中检测出SPCSV。检测灵敏性研究表明,用体外转录的RNA作为核酸模板,RT-PCR可检测的最低浓度为5.69×104拷贝/μL,半巢式RT-PCR为5.69×101拷贝/μL,说明半巢式RT-PCR检测方法的灵敏性比RT-PCR高1 000倍。

抗磷脂酶A2受体抗体与特发性膜性肾病的关系

目的 探讨抗磷脂酶A2受体（PLA2R）抗体对特发性膜性肾病（IMN）的诊断和病情活动监测价值.方法 选择2012年1月至2014年3月北京协和医院行肾活检并确诊的IMN 233例,以同期46例非IMN肾脏疾病为对照,采用定量ELISA检测肾活检时血清抗PLA2R抗体滴度.绘制抗PLA2R抗体诊断IMN的ROC曲线.结果 抗PLA2R抗体在IMN中总敏感性为60.0％,特异性为100.0％,检测前未行免疫抑制治疗者的阳性率为71.3％,其中25例狼疮性肾炎患者抗体均阴性.肾病范畴蛋白尿者抗体阳性率为68.3％,非肾病范畴蛋白尿者抗体阳性率为41.7％（P＜0.05）;血白蛋白低于30 g/L者抗体阳性率为67.3％,高于血白蛋白＞30 g/L者（44.6％;P＜0.05）.抗体滴度水平越高,则低白蛋白血症越严重（P＜0.05）,肾病范畴蛋白尿的比例越高（P＜0.05）.抗PLA2R抗体诊断IMN的AUCRoc为0.800.结论 抗PLA2R抗体对IMN诊断具有较高的敏感性和特异性,诊断准确性良好.抗体阳性率受免疫抑制治疗、病情活动等因素影响.抗PLA2R抗体可反映IMN的活动性.