Bacillus subtilis 168中亚硝酸盐还原酶基因的敲除及表型鉴定

该研究首先通过同源重组方式将Bacillus subtilis 168菌株nir基因位点置换为两端具有同向排列的loxP序列选择性标记基因,再运用Cre重组酶将两个loxP间的全部序列切除,成功敲除了Bacillus subtilis 168菌株亚硝酸盐还原酶(nitrite reductase,NiR)的3个亚基基因nasB、nasD和nasE。其中,敲除nasD基因的B.subtilis 168菌株在不同生长时期均未分解培养基中亚硝酸盐,表明该nasD基因缺陷型菌株NiR活性已被完全消除,不再具备降解亚硝酸盐的能力。

农杆菌介导法将硝酸还原酶基因转入大白菜的研究

[目的]建立大白菜的硝酸还原酶基因(NR)转化体系。[方法]以大白菜北京小杂60为材料,通过农杆菌LBA4404介导,将硝酸还原酶基因(NR)转入大白菜,对获得的转NR基因苗进行PCR检测、Southern杂交检测以及硝酸盐含量测定。[结果]试验初步建立了一套大白菜的转化体系,即以预培养2d苗龄4d的大白菜不带柄半子叶为外植体,在OD600nm值约为0.6的农杆菌工程菌液中浸染8min,然后在pH值为5.8且不加抗生素的分化培养基中将子叶与菌共培养2d,其后经过诱导、抗生素筛选、生根生长等过程,获得抗性植株,转化频率为6.48%。对抗性植株采用分级筛选,获得8株转NR基因苗。[结论]试验证实,NR基因已整合进大白菜的基因组中并得到表达,植株体内的硝酸盐含量均低于对照。

硝酸盐对硝酸还原酶活性的诱导及硝酸还原酶基因的克隆

硝酸盐在植物体内的积累过多已成为影响蔬菜品质并影响人类健康的重要因素。硝酸还原酶 (NR)是硝酸盐代谢中的关键酶 ,提高其活性有利于硝酸盐的降解。为了解植物不同组织中NR的活性 ,用活体测定法检测了经 5 0mmol L的KNO3诱导不同时间后的油菜、豌豆和番茄幼苗根茎叶中NR活性 ,同时为了明确外源诱导剂浓度与植物体内NR活性的关系 ,检测了经不同浓度KNO3诱导 2h后的矮脚黄、抗热 6 0 5、小白菜和番茄叶片中的NRA。结果表明 ,不同植物组织NR活性有很大差异 ,叶中NR活性较高 ,根其次 ,茎最低 ;不同植物的NR活性随诱导时间呈不同的变化趋势 ,相同植物不同组织的NR活性变化趋势相似 ;不同植物叶片NRA为最高时KNO3浓度不同。用30mmol L的KNO3诱导番茄苗 2h后 ,从番茄根和叶中提取总RNA ,用RT PCR方法获得NRcDNA ,全长 2 736bp ,编码911个氨基酸。

外源硝酸还原酶(NR)抑制剂对油菜植株内NR活性的影响及其与硝酸盐含量的关系

为进一步揭示硝酸还原酶(nitrate reductase,NR)活性的调控机制及其与植株体内硝酸盐含量的关系。本试验在正常供氮(15 mmol L^(–1)NO_3~–)和缺氮(7.5 mmol L^(–1)NO_3~–)条件下,以氮高效(H1:742和H2:Xiangyou 15)和氮低效(L1:814和L2:H8)油菜基因型为研究材料,通过NR活性的专性抑制剂处理,研究NR活性和硝酸盐含量的基因型和氮水平差异。结果表明,NR专性抑制剂处理可以显著降低叶片NR活性,正常供氮和缺氮条件下分别降低53.0%和57.6%,但对叶片硝酸盐的含量没有显著影响。正常供氮条件下的NR活性和硝酸盐含量比缺氮条件下分别高46.9%和16.4%。氮高效油菜基因型的硝酸盐含量显著低于氮低效基因型。H2的NR活性(NRA_(act))显著高于氮低效基因型的本质原因是其主效基因(nia2)的相对表达量高于氮低效基因型。本研究充分表明NR活性和硝酸盐含量存在明显的基因型和氮水平差异,一定程度的NR活性变化对植株体内硝酸盐的含量并没有显著的影响。

甜菜亚硝酸还原酶(NiR)基因的克隆与表达分析

以甜菜品种甜研7号叶片的cDNA为模板,采用RT-PCR和3′/5′RACE技术,获得了编码亚硝酸还原酶基因(NiR)的cDNA全序列2014bp,包含有1830bp的开放阅读框,编码599个氨基酸。所推导的氨基酸序列与菠菜及拟南芥NiR编码的氨基酸序列均具93%的同源性。生物信息学分析表明,甜菜NiR具有完整的NiR蛋白结构,含血红素蛋白β-化合物区域和4Fe-4S区域,并利用分析软件预测其三维结构。实时荧光定量结果显示,在以0、10、20、30、40、50、80和160mmol L-1NO3–-N处理72h的试验中,50mmol L-1处理可使甜菜NiR的表达量达到最大;以0、2、4、8、16、32、64和128mmol L-1NH4+-N处理48h的试验表明,8mmol L-1和64mmol L-1处理条件下甜菜NiR表达量相对较高。硝态氮和铵态氮不同配比处理48h的试验中,NO3–-N和NH4+-N比例为80∶20可使甜菜NiR的表达量达到最大;在氮素诱导的基础上,蛋白抑制剂放线菌酮处理9h,随着处理浓度的增大,NiR的表达量逐渐下降;不同浓度NO2–处理的试验中,40mmol L–1处理下NiR的表达量最大。

四川泡菜中植物乳杆菌亚硝酸盐还原酶基因克隆与表达

目的:对植物乳杆菌中亚硝酸盐还原酶基因进行克隆并表达,并测定酶的活力。方法:根据Gen Bank中亚硝酸盐还原酶(NIR)基因序列,设计引物。提取植物乳杆菌的DNA,采用PCR技术扩增nir基因,TA克隆构建获得重组质粒p MD19-nir,分析其核苷酸序列同源性。通过双酶切连接到表达载体p ET-32a(+)中,获得重组表达载体p ET-32a-nir,构建成功后转化到E.coli BL(DE3)中进行表达研究。经IPTG诱导表达,得重组蛋白,超声波破碎,提取粗酶液,测定酶活力。结果:克隆的目的基因序列长度为1638 bp。获得重组蛋白分子量为80 ku,酶活力为4.2 U/mg。结论:成功克隆了植物乳杆菌中的亚硝酸盐还原酶基因,成功的导入到E.coli BL(DE3)中,表达产物有酶活。

杜氏盐藻硝酸盐还原酶基因5′上游序列的克隆与功能分析

目的:克隆杜氏盐藻硝酸盐还原酶(NR)基因5′上游序列,并对其功能进行分析。方法:利用BamHI、EcoRI、HindIII、PstI、SalI、Xbal6种限制性内切酶分别酶切盐藻基因组DNA,并与接头连接,构建成盐藻基因组步行文库。采用LA-PCR方法,从上述盐藻步行基因组文库中扩增NR基因5′上游序列,测序并进行分析。为检测其表达特性,构建了该片段与GUS嵌合基因的表达载体pNR-GUS,通过电击法将所构建的重组表达载体转化盐藻,组织化学染色法观察GUS的表达。结果:从盐藻基因组步行文库中扩增出约1200bp特异片段,序列分析表明5′上游序列含有启动子的特征性序列。GUS瞬时表达染色结果显示,该DNA片段具有硝酸盐诱导和铵抑制的启动子活性。结论:所克隆的盐藻的5′上游序列可能是一种具有“开关”活性的可控性启动子。

植物乳杆菌亚硝酸盐还原酶基因在大肠杆菌中表达

构建乳杆菌亚硝酸盐还原酶基因的重组质粒并表达。以植物乳杆菌基因组DNA为模板,PCR扩增亚硝酸盐还原酶基因,连接到表达载体pET-32a(+)上,构建的重组载体转入大肠杆菌BL21(DE3)中,经IPTG诱导表达后,菌体总蛋白经SDS-PAGE鉴定显示重组质粒诱导表达产物有特异性蛋白条带。该表达产物经细菌亚硝酸盐还原酶试剂盒测定显示有明显的酶活性。实验结果为深入研究植物乳杆菌亚硝酸盐还原酶提供有益的参考。

菠菜硝酸还原酶基因的克隆与原核表达

利用RT-PCR技术从低富集硝酸盐的菠菜品种中克隆得到硝酸还原酶(NR)基因,并进行了同源性分析;构建该基因的原核表达载体pET-NR,转入大肠埃希菌BL21(DE3)中,用IPTG进行诱导表达,为深入研究并揭示菠菜的硝酸盐富集机制奠定了基础。结果表明:获得的NR基因包含完整的开放阅读框(2 781 bp),编码926个氨基酸,与菠菜、甜菜NR核苷酸序列的同源性分别为99%、80%,与其氨基酸序列的相同性分别为99%、86%。SDS-PAGE电泳显示重组菌经IPTG诱导表达出104 ku左右的蛋白质,与预期大小一致。

木糖氧化产碱菌中亚硝酸盐还原酶基因的克隆与表达

目的:对木糖氧化产碱菌中亚硝酸盐还原酶基因(nir)进行克隆并表达,并测定酶的活力,探讨亚硝酸盐还原酶(NiR)对亚硝酸盐的降解特性。方法:提取木糖氧化产碱菌DNA,根据GenBank公布的nir基因序列设计引物,利用PCR技术扩增nir基因,克隆至表达载体pET-28a中,构建重组质粒pET-28a-nir,通过双酶切和测序鉴定后,将阳性重组质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)中,经IPTG诱导表达,获得重组蛋白。将细胞发酵液超声破碎,提取粗酶,测定酶活力。结果:经PCR扩增及测序鉴定得到长度为1 083bp的目的片段;经终浓度0.6mmol.L-1IPTG、30℃诱导表达5h,获得相对分子质量为37 000的重组蛋白;在pH6.5、反应温度35℃时,测得酶活力为51.74U.mL-1。结论:成功克隆nir基因,在大肠杆菌BL21(DE3)中获得表达,且表达产物有酶活。

不同基因型小麦生育期硝酸还原酶活性的比较

小麦不同基因型各生育时期的叶片硝酸还原酶（ＮＲ）活性在开花前后为最大，开花前呈上升趋势，开花之后随籽粒灌浆而逐渐下降，穗部（籽粒和颖片）ＮＲ活性在开花后逐渐上升，开花后１５～２１ｄ达到最大，之后又逐渐下降；气温和日照时数与ＮＲ活性呈正相关，降水量与ＮＲ活性为负相关。

甜菜硝酸还原酶全长基因的克隆及其在缺氮胁迫下表达与活性分析

用50 mmol.L-1KNO3溶液处理的甜菜幼苗提取总RNA,通过RT-PCR法从甜菜总RNA中分离得到一个硝酸还原酶基因,其cDNA长2 760 bp,包含了完整的基因编码序列,与已公布的硝酸还原酶基因序列相似性达99%。同时利用活体测定法检测了经缺氮胁迫不同时间后甜菜叶中NR活性,并利用NR片段引物进行半定量RT-PCR,检测了基因的表达量。结果表明,随着缺氮处理时间的延长,甜菜叶中的NR活性随诱导时间增加活性逐渐降低,在缺氮处理1 h,其活性便有明显的降低;而NR的mRNA受缺氮胁迫下调表达,暗示着NR基因的表达与氮诱导相关。

杜氏盐藻硝酸盐还原酶基因5′上游序列的克隆与序列分析

目的:克隆杜氏盐藻硝酸盐还原酶(NR)基因5′上游序列,并对其进行测序和序列分析。方法:提取杜氏盐藻基因组DNA,经过BamHI、EcoRI、HindⅢ、PstI、SalⅠ及XbalⅠ限制性内切酶分别酶切后,再与相应接头连接,分别构建盐藻步行基因组文库BL、EL、HL、PL、SL和XL。采用巢式(LA)-PCR方法,从上述步行基因组文库中扩增杜氏盐藻NR基因5′上游序列,克隆至pMD18-T,对酶切鉴定正确的克隆进行测序。结果:从HL里扩出约1200bp特异性片断,回收此片段并进行T载体克隆,对阳性克隆测序。该序列的3′端与已知NR基因cDNA5′端序列完全一致。该序列含有多个与转录调控有关的保守序列(如CAAT-box和GAGA-box),含有与EBP、EFII、NF-E1、LV等转录因子以及广谱激活剂Oct-1结合位点相似的核苷酸序列。结论:采用LA-PCR基因组步行方法,从已知cDNA周围未知启动子或其他调控区域中克隆得到的NR基因的5′上游区序列,可能是一种新的杜氏盐藻启动子区序列。

棉花体细胞胚胎发生相关基因——亚硝酸还原酶基因的克隆与生物信息学分析

利用生物信息学方法,以水稻的NiR基因序列为基础,克隆棉花亚硝酸还原酶基因的开放阅读框,并对序列进行氨基酸组成、二级结构、疏水性及信号肽进行等预测分析,同时与4个物种的NiR基因进行了同源性比较。结果成功地克隆了NiR基因,该研究结果对研究棉花体细胞胚胎发生和基因的关系奠定了一定的基础。

春小麦NPK营养效率基因型差异的生理机理 I.硝酸还原酶活性和CO_2同化能力的基因型差异

采用田间与盆栽试验以及测试分析相结合的方法，在不施肥（ＣＫ）和施肥（ＮＰＫ）条件下，研究了耐低ＮＰＫ养分的高效、中效和低效基因型小麦的硝还原酶活性、叶绿素含量和光合速率的基因型差异。结果表明，耐低ＮＰＫ养分的高效基因型，在不施肥条件下具有较高的硝酸还原酶活性、叶绿素含量和光合速率，相对硝酸还原酶活性、相对叶绿素含量和相对光合速率也较高。相关分析表明，小麦相对产量与相对硝酸还原酶活性、相对叶绿素含量、相对ＣＯ２同化速率间呈极显著正相关，表明耐低ＮＰＫ养分的高效基因型之所以相对产量较高，是因为体内相对吸收同化ＮＯ－３和同化ＣＯ２的能力较强所致；低效基因型正相反；中效基因型介于二者之间。

春小麦NPK营养效率基因型苗期根系活力和硝酸还原酶活性的差异

采用田间试验与水培试验以及测试分析相结合的方法 ,在不施肥 (CK)和施肥 (NPK)条件下 ,研究了耐低NPK养分效率的高效、中效、低效基因型春小麦苗期的根系活力和硝酸还原酶活性的差异。结果表明 ,耐低NPK养分的高效基因型春小麦 (Ⅰ类基因型 )在不施肥条件下 ,苗期根系活力和硝酸还原酶活性较高 ,籽粒产量和生物产量较高 ;耐低NPK养分的低效基因型 (Ⅲ类基因型 ) ,在施足肥条件下硝酸还原酶活性较高 ,籽粒产量和生物产量较高 ;中效基因型 (Ⅱ )介于Ⅰ和Ⅲ类基因型之间。

甜菜硝酸还原酶活性分析及基因片段的克隆

为了明确缺氮条件下甜菜NR的活性,用活体测定法检测了经缺氮胁迫不同时间后甜菜叶中NR活性.结果表明,随着缺氮处理时间的延长,甜菜叶中的NR活性逐渐降低,在缺氮处理1 h后,其活性下降较快.用50 mmol/L KNO3溶液处理的甜菜幼苗总RNA,通过RT-PCR分离得到了硝酸还原酶基因片段,长度为471 bp,Blast分析表明,其与Genbank中硝酸还原酶基因部分序列具有高度同源性.

杜氏盐藻硝酸盐还原酶基因5′上游序列驱动bar基因的表达

目的:探讨杜氏盐藻硝酸盐还原酶(NR)基因5′上游序列(Pnr)是否可以驱动外源基因在杜氏盐藻中的表达。方法:利用改进的重叠区扩增基因拼接法(SOEing),将杜氏盐藻NR基因5′上游序列(Pnr)与除草剂抗性基因bar融合。同时将NR基因3′端序列(Tnr)与克隆载体pEGM-7zf连接,构成中间载体pEGM-7zf-Tnr。最后将融合片段Pnr-Tnr与中间载体连接,构建含Pnr-bar-Tnr表达盒的盐藻真核表达载体p7NBT。电击法转化杜氏盐藻,通过草丁膦培养筛选转化藻株后对其进行分析。结果:转化藻株总RNA的RT-PCR结果扩增出与bar基因序列完全一致的目的片段。结论:杜氏盐藻NR基因Pnr能够驱动外源基因bar的转录。

甘蓝过量表达硝酸还原酶基因对硝酸盐积累的影响

为探索过量表达硝酸还原酶基因对甘蓝（Brassicaoleracea L.var.capitata L.）硝酸盐积累的影响,以‘中甘11号’下胚轴为外植体,采用根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）介导法将烟草硝酸还原酶基因（NR）导入甘蓝,获得13株卡那霉素抗性植株.PCR和Southern blot检测证实,NR基因已经成功导入并整合到甘蓝的基因组.4个转基因株系硝酸盐质量分数明显低于非转基因供体株系,降幅为13.9％～23.0％.说明：将重组硝酸还原酶基因导入甘蓝且得到超量表达,创制低硝酸盐育种材料的方法可行.

硝酸还原酶合成的NO通过诱导酸敏感水稻根尖ROS积累引起酸毒

酸毒是酸性土壤中限制作物生长的重要因子之一,但酸毒通常与金属离子毒性共存,难以在土壤中直接研究,目前关于水稻酸毒机制的报道较少。选用前期筛选的酸耐性不同的两个水稻品种Kasalath(酸耐性)和Jinguoyin(酸敏感),研究水稻的酸敏感性与活性氧(ROS)积累及氧化还原代谢相关酶的关系,并试图探讨酸毒害中一氧化氮(NO)信号与活性氧信号的调控关系。结果显示,低pH引起酸敏感水稻品种Jinguoyin中根尖NO和ROS的富集,但酸耐性水稻品种Kasalath中无显著变化。NO清除剂2-(4-羧基苯基)-4,4,5,5-四甲基咪唑啉-1-氧基-3-氧化物钾盐(cPTIO)可清除Jinguoyin根尖富集的NO和ROS。硝酸还原酶反馈抑制剂谷氨酰胺(Gln)可明显降低Jinguoyin在低pH下的根尖NO信号,而一氧化氮合酶抑制剂N’-硝基-L-精氨酸甲酯盐酸盐(L-NAME)对根尖NO信号无影响。低pH显著提高了Jinguoyin中硝酸还原酶基因NIA1、NIA2和NIA3的表达,同时也提高了硝酸还原酶活性。可见,低pH下Jinguoyin受到的酸毒与NO介导的ROS富集有关,酸毒下产生的NO信号主要由硝酸还原酶合成,其硝酸还原酶基因NIA1和NIA2的表达调控硝酸还原酶活性的提高。