反义硫代脱氧寡核苷酸体外抑制CVB持续感染的研究

目的:了解21聚体反义硫代脱氧寡核苷酸(AODN)体外对CVB3、CVB5持续感染的抑制作用。方法:人工合成AODN,进行脂质体包埋,并按不同浓度分别加入CVB3-ECV304、CVB5-ECV304持续感染细胞模型。对药物作用后持续感染细胞模型,观察其培养上清液致Vero细胞病变能力的改变;ELISA法检测CVB3、CVB5抗原产生的抑制率;RT-PCR检测细胞内病毒RNA表达情况;ELISA检测培养上清液分泌TNF-α浓度。同时进行正义和随机寡核苷酸(SODN、RODN)抗病毒能力检测,并与AODN结果比较。结果:AODN可抑制持续感染CVB3、CVB5抗原合成,随药物浓度的增高,抗原抑制率也升高;经AODN作用后,持续感染细胞培养上清液致Vero细胞病变能力下降,上清液中病毒滴度减少;RT-PCR在经AODN作用的CVB3-ECV304、CVB5-ECV304组中未检测到病毒RNA;经AODN作用后,持续感染的CVB3-ECV304、CVB5-ECV304细胞产生TNF-α浓度升高;针对CVB35′端非编码区基因组序列合成的AODN对CVB5持续感染也有较强的抑制作用;AODN对持续感染病毒的抑制作用强于SODN和RODN组。结论:AODN能体外抑制CVB3、CVB5持续感染,刺激细胞合成TNF-α。这种作用有序列特异性,但同组间病毒有交叉抑制作用,这种作用可能与CVB3、CVB5基因序列同源有关。

细胞周期素G_1反义硫代脱氧寡核苷酸抑制HL-60细胞在裸鼠体内生长的实验研究

目的 探讨细胞周期素G1 (cyclinG1 )反义硫代脱氧寡核苷酸对HL 6 0细胞在裸鼠体内生长的抑制作用。方法 将裸鼠随机分成对照组、正义寡核苷酸 (SON)组、反义寡核苷酸 (ASON)组 ,其中SON组和ASON组接种转染的HL 6 0细胞 (HL 6 0 S和HL 6 0 AS)前接受 3Gy的6 0 Co照射 ;将各组HL 6 0细胞接种于裸鼠皮下连续观察裸鼠的出瘤时间、瘤体大小 ,计算抑瘤率 ;病理切片用苏木精 伊红染色 ,电镜观察移植瘤组织的结构和细胞形态变化 ;用流式细胞仪 (FCM)和RT PCR分别检测cyclinG1 蛋白和mRNA水平的表达 ;电镜和FCM检测细胞凋亡。结果 ①cyclinG1 ASON组与SON组和对照组比较 ,对HL 6 0细胞在裸鼠体内生长有明显抑制作用 ,抑瘤率为 6 9.4 %。成瘤率、瘤重、瘤体积明显小于SON组和对照组。②镜下见cyclinG1 ASON组的HL 6 0细胞部分细胞形态发生改变 ,核分裂象少见 ,细胞的异型性较小 ,并且有凋亡细胞出现。结论 cyclinG1 ASON能明显抑制HL 6 0细胞在裸鼠体内的生长 ,并且促使部分细胞发生凋亡。

Bax反义硫代脱氧寡核苷酸的体外抗辐射效应研究

目的 :Bcl_2 Bax蛋白比值降低是辐射所致细胞凋亡启动的检查点。本研究拟用Bax反义核酸干预Bax基因的表达 ,提高Bcl_2 Bax蛋白比值 ,抑制辐射所致凋亡 ,促进细胞存活。方法 :人胚肺成纤维细胞 (HELF)和小鼠受γ射线照射后 ,立即用Bax反义脱氧寡核苷酸处理HELF细胞和小鼠骨髓细胞 6h(终浓度均为 10 0nmol L) ,用MTT法、SRB法和小鼠骨髓中性粒细胞_巨噬细胞系祖细胞 (CFU_GM)集落形成法 ,确定细胞的存活状况。用RT_PCR方法和流式细胞仪检测BaxmRNA的表达状况、细胞周期的变化 ,分析其作用机制。结果 :HELF细胞的存活率分别增加 2 4 .4 % (MTT法 ,P <0 .0 1)和 12 .8% (SRB法 ,P <0 .0 1) ;骨髓细胞处理组CFU_GM集落形成数量远高于照射对照(72± 17vs 13± 6 ,P <0 .0 1) ;RT_PCR检测显示 ,处理组的目标条带和内标条带的灰度比值 (Bax β_actin)低于对照组(分别为 4 3.9%和 6 8.6 % ) ;流式细胞仪检测表明 ,处理组总S期细胞的比例高于对照组 ,分别为 2 4 .2 %和 7.7% ,提示处理组细胞内BaxmRNA拷贝数量低于对照组 ,细胞增殖活动较强。结论 :靶向BaxmRNA的反义硫代脱氧寡核苷酸 ,能够促进γ射线辐射后细胞的存活 ,其机制与破坏靶mRNA分子 ,继而造成Bax蛋白表达减少 ,抑制凋亡启动并促进细胞增殖活动有关。

硫代反义脱氧寡核苷酸对脑胶质瘤SWO-38细胞的作用

目的 研究α1,4半乳糖糖基转移酶 (α1,4GalT)基因硫代反义核酸对脑胶质瘤细胞系SWO -3 8细胞的增值与凋亡的影响及其与Bcl -2和Bax表达的关系。方法 采用脂质体介导的基因转染方法将人工合成α1,4GalT基因反义核酸转入SWO -3 8细胞中。应用RT -PCR检测对α1,4GalTmRNA表达的影响 ,应用克隆形成实验检测对细胞增殖的作用 ,应用流式细胞术 (FCM)和琼脂糖凝胶电泳检测细胞凋亡的发生 ,应用FCM检测Bax和Bcl -2表达的变化。结果 反义核酸转染后 ,经RT -PCR检测证实α1,4GalTmRNA基因的表达下降 ;克隆形成试验显示细胞生长明显受到抑制 (P <0 .0 1) ;FCM检测表明 ,导入α1,4GalT基因反义核酸的SWO -3 8细胞的凋亡明显增加 (P <0 .0 1) ,Bcl -2蛋白表达显著下降 (P <0 .0 1) ,而Bax蛋白表达显著提高 (P <0 .0 1)。结论 α1,4GalT基因硫代反义核酸可诱导脑胶质瘤细胞系SWO -3 8细胞凋亡 。

反义VEGF硫代寡脱氧核苷酸抑制裸鼠人肝癌移植瘤生长的研究

目的 :检测硫代修饰的反义脱氧寡核苷酸 (ASPODN)抑制人肝癌血管形成和生长的作用 ,以探讨ASPODN的临床应用前景。方法 :传代培养的肝癌细胞系HepG2 ,接种于裸鼠颈背部皮下 ,自 4 8h始局部注射ASPODN和等量的PBS ,彩色多普勒能量图 (CDE)检测移植瘤内新生血管的数目和分布 ;LSAB法免疫组化染色检测移植瘤中微血管密度 (MVD) ;FCM分析裸鼠移植瘤细胞周期动力学和凋亡率。结果 :局部注射ASPODN组和PBS对照组 ,裸鼠人肝癌移植瘤瘤重及MVD平均值分别为 ( 1.2 8±0 .2 6)g、2 6.90± 7.4 2和 ( 3.4 6± 0 .86)g、50 .36± 10 .2 7(P <0 .0 1) ;局部注射ASPODN组 ,用CDE动态检测到移植瘤内的血管数目及血流丰富程度明显低于PBS组P <0 .0 1;经ASPODN治疗后的裸鼠人肝癌移植瘤细胞凋亡率 ( 7.4 8± 1.64) %高于PBS对照组 ( 2 .75± 0 .2 2 ) % (P <0 .0 1)。结论 :VEGFAS PODN明量抑制肝癌血管形成和生长 。

Sanger测序法确证硫代修饰反义脱氧寡核苷酸的序列

目的 :建立一种简便、可靠的硫代修饰反义脱氧寡核苷酸序列确证方法 ,为反义药物的质量控制及新药研究与开发奠定基础。方法 :选择含有待测反义脱氧寡核苷酸序列在内的一段靶基因为模板 ,以待测序的硫代修饰反义脱氧寡核苷酸作为下游引物 ,同时在其上游设计一条引物 ,进行PCR扩增 ,使待测序的反义序列以修饰形式掺入到PCR扩增产物中 ;以上述掺入反义序列的PCR扩增产物为模板 ,利用Sanger双脱氧链终止测序法对其进行自动序列分析。结果 :该方法可对不同长度硫代修饰的反义序列进行测定 ,并且可有效地检测出合成过程中产生的突变和缺失序列 ,与质谱法相比 ,仪器和试剂更普及 ,方法易于掌握且测序成本低 ,用样量少。结论 :该方法可用于硫代修饰反义脱氧寡核苷酸药物的序列确证。

Livin mRNA的反义核酸诱导MCF-7乳癌细胞凋亡作用(英文)

目的 :以livinmRNA为靶点设计反义硫代脱氧寡核苷酸 (PS ODNs) ,探讨其体外抗肿瘤效应及其机制。方法 :设计以livinmRNA为靶点的反义核酸并作用于MCF 7乳癌细胞 ,用MTT、RT PCR和流式细胞仪检测等方法对其进行评价研究。结果 :在设计的一些反义核酸中 ,YMZ0 5能够有效地抑制livin基因的表达 ,增加caspase 3的活性 ,诱导MCF 7细胞凋亡 ,明显抑制其生长 ,结论 :通过抑制livin基因的表达能够抑制MCF 7乳癌细胞生长、诱导其凋亡 ,livin可能会成为抗肿瘤的新靶点。