茱萸丸抑制氧化三甲胺介导的ROS/TXNIP/NLRP3信号通路诱导血管内皮细胞焦亡

目的研究茱萸丸对动脉粥样硬化(atherosclerosis,AS)的影响及其相关机制。方法采用高脂饲料喂养雄性低密度脂蛋白受体敲除(low density lipoprotein receptor knockout,LDLR−/−)小鼠诱导AS模型,造模周期为12周。造模成功的50只LDLR−/−小鼠随机分成模型组及茱萸丸低、中、高剂量(130.54、261.08、552.16 mg/kg)组和阿托伐他汀(10.40 mg/kg)组,每组10只,C57BL/6J小鼠10只作为对照组。给药12周后,采用生化法检测小鼠血清三酰甘油(triglyceride,TG)、总胆固醇(total cholesterol,TC)、低密度脂蛋白胆固醇(low density lipoprotein cholesterol,LDL-C)、高密度脂蛋白胆固醇(high density lipoprotein cholesterol,HDL-C)水平;苏木素-伊红(hematoxylin-eosin,HE)、Masson、油红O染色观察小鼠主动脉的病理学改变;ELISA检测血清中白细胞介素-18(interleukin-18,IL-18)、IL-1β、活性氧(reactive oxygen species,ROS)水平和超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)活性;超高液相色谱串联质谱法(ultra-high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry,UHPLC-MS/MS)检测小鼠血浆中三甲胺(trimethylamine,TMA)、氧化三甲胺(trimethylamine oxide,TMAO)含量;16S rRNA技术检测小鼠粪便中肠道菌群物种组成差异;荧光探针法检测主动脉ROS的荧光强度;免疫荧光及Western blotting检测小鼠主动脉硫氧还蛋白相互作用蛋白(thioredoxin interacting protein,TXNIP)和核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白(NOD like receptor family pyrin domain containing 3,NLRP3)蛋白表达;qRT-PCR检测主动脉硫氧还蛋白(thioredoxin,TRX)、TXNIP、凋亡相关斑点样蛋白(apoptosis-associated speck-like protein,ASC)、NLRP3、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(cystein-asparate protease-3,Caspase-3)mRNA表达。结果与对照组比较,模型组小鼠血清TC、TG、LDL-C水平升高(P<0.01),HDL-C水平显著下降(P<0.01),主动脉内膜大面积增厚,形成明显的泡沫细胞,脉壁胶原蛋白沉积增多,血清中IL-18、IL-1β、ROS、TMA、TMAO水平显著升高(P<0.01),SOD活性显著降低(P<0.01),Chao1、Ace以及observed species指数降低(P<0.01),拟杆菌门、粪杆菌属、布劳特氏属、乳杆菌属菌群丰度显著下降(P<0.01),主动脉中ROS含量增加(P<0.01),TXNIP、NLRP3蛋白与mRNA表达水平升高(P<0.01),TRX、ASC、Caspase-1 mRNA表达水平升高(P<0.01)。与模型组比较,茱萸丸组血清TG、TC、LDL-C水平显著降低(P<0.05、0.01),HDL-C水平显著升高(P<0.01),主动脉斑块、血管壁泡沫细胞及胶原蛋白沉积均呈现不同程度的改善,血清中IL-18、IL-1β、ROS、TMA、TMAO水平显著降低(P<0.05、0.01),SOD活性显著升高(P<0.01),Chao1、Ace以及observed species指数均明显升高(P<0.01),拟杆菌门、粪杆菌属、布劳特氏属、乳杆菌属菌群丰度升高(P<0.05、0.01),厚壁菌门菌群丰度降低(P<0.05),主动脉中ROS含量减少(P<0.05、0.01),TXNIP、NLRP3蛋白与mRNA表达水平显著降低(P<0.01),TRX、ASC、Caspase-1 mRNA表达水平显著降低(P<0.01)。结论茱萸丸能够显著抑制LDLR−/−AS小鼠主动脉病理改变、调节肠道菌群中有益菌和有害菌的相对丰度,减少TMAO生成,抑制ROS/TXNIP/NLRP3信号通路,改善炎症反应,减轻内皮细胞损伤,从而发挥抗AS的作用。

硫氧还蛋白相互作用蛋白/核苷酸结合寡聚化结构域样受体热蛋白结构域包含蛋白3信号通路与糖尿病及其慢性并发症的研究进展

糖尿病是一组以高血糖为特征的代谢性疾病,长期的慢性高血糖会激发机体的氧化应激、慢性炎症以及细胞程序性死亡等病理过程,进而导致不同器官的进行性病变、功能减退及衰竭。硫氧还蛋白相互作用蛋白(TXNIP)在高血糖及氧化应激条件下会结合核苷酸结合寡聚化结构域样受体热蛋白结构域包含蛋白3(NLRP3)继而激活NLRP3炎症小体引起一系列炎症反应参与糖尿病及其慢性并发症的发生与发展。该文将就TXNIP/NLRP3信号通路与糖尿病及其慢性并发症的研究进展作一综述。

基于TXNIP/NLRP3信号通路研究根皮素对糖尿病肾病小鼠肾脏自噬和纤维化的影响

目的:基于硫氧还蛋白相互作用蛋白/核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3(TXNIP/NLRP3)信号通路研究根皮素对糖尿病肾病(DN)小鼠肾脏自噬和纤维化的影响及分子机制。方法:采用腹腔注射链脲佐菌素30 mg/kg建立DN小鼠模型。随机将小鼠分为正常对照组、模型对照组、吡格列酮10 mg/kg组、根皮素200、400 mg/kg组,每组10只。小鼠连续灌胃根皮素10 w后,测定各组小鼠肾脏肥大指数,采用HE染色、PAS染色和Masson染色观察小鼠肾脏病理形态学变化和肾纤维化改变程度,检测小鼠血糖、体质量、饮水量、尿量、尿β2微球蛋白(β2-MG)含量,取血清测定尿素氮(BUN)、肌酐(Scr)含量,酶联免疫吸附法(ELISA)测定血清中白细胞介素-1(IL-1)、IL-18、转化生长因子-β1(TGF-β1)含量;采用免疫组化法测定肾组织盘状结构域受体1(DDR1)、TXNIP、NLRP3、IL-1β、自噬效应蛋白Beclin-1、微管相关蛋白1轻链3-Ⅱ(LC3-Ⅱ)蛋白表达,并用Western blot法检测肾脏TGF-β1、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、Beclin-1、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ蛋白表达。结果:与正常对照组比较,模型对照组小鼠血糖、血清BUN、Scr、IL-1、IL-18、TGF-β1、尿β2-MG含量显著升高,肾脏肥大指数显著增加(P<0.01);肾脏DDR1、TXNIP、NLRP3、IL-1β、TGF-β1、α-SMA蛋白表达显著上调(P<0.01),Beclin-1显著上调、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值显著降低(P<0.01);与模型对照组比较,根皮素200、400 mg/kg组和吡格列酮10 mg/kg组小鼠血糖、血清BUN、Scr、IL-1、IL-18、TGF-β1、尿β2-MG含量显著降低,肾脏肥大指数显著降低(P<0.01);肾脏DDR1、TXNIP、NLRP3、IL-1β、TGF-β1、α-SMA蛋白表达显著下调(P<0.01),Beclin-1蛋白表达上调、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值显著升高(P<0.01),肾脏病理形态和纤维化明显改善。结论:根皮素能提高肾脏自噬水平并抑制肾纤维化,其机制可能与调控TXNIP-NLRP3信号通路减轻炎症反应有关。

基于TXNIP信号通路调控的艳山姜挥发油对高糖诱导血管内皮细胞损伤的保护作用

目的:研究艳山姜挥发油(EOAZF)对高浓度葡萄糖(HG)诱导人脐静脉内皮细胞(HUVECs)损伤的保护作用,为研究EOAZF改善糖尿病诱导的心血管疾病提供实验依据。方法:该项目研究分为正常组,模型组(25 mmol·L^(-1)葡萄糖组),阳性药组(100 mg·L^(-1)维生素C),EOAZF低、中、高浓度组(0.25,1,4μg·L^(-1))。通过建立HG诱导HUVECs损伤模型,检测不同给药组内皮细胞中的丙二醛(MDA),一氧化氮(NO)和内皮素1(ET-1)的分泌量,评价EOAZF对高糖诱导HUVECs损伤的保护作用;采用AnnexinV-FITC/PI双染实验以及DCFH-DA荧光探针标记,考察EOAZF对HG诱导HUVECs的凋亡水平和活性氧(ROS)产生的影响;采用蛋白免疫印迹法(Western blot),实时荧光定量聚合酶链式反应(Real-time PCR),检测硫氧还原蛋白相互结合蛋白(TXNIP)与硫氧还原蛋白(Trx-1)蛋白表达和转录水平,采用胰岛素二硫键还原法测定细胞内总Trx-1的酶活性。结果:细胞形态学结果显示,与正常组比较,模型组HUVECs增殖速度明显降低,细胞形态受损;与模型组比较,0.25,1,4μg·L^(-1)EOAZF对HG诱导损伤的HUVECs具有保护作用,且呈浓度依赖性;与正常组比较,模型组显著上调HUVECs内MDA和ET-1分泌量(P<0.05),下调NO的分泌(P<0.01);与模型组比较,不同浓度EOAZF均能改善HG诱导的MDA,ET-1和NO的分泌,其中4μg·L^(-1)EOAZF能明显降低HG诱导的HUVECs细胞MDA和ET-1的分泌量(P<0.05),明显上调HUVECs细胞NO的分泌量(P<0.05);细胞凋亡和ROS检测结果显示,与正常组比较,模型组细胞凋亡和ROS水平均显著上调(P<0.01);与模型组比较,4μg·L^(-1)EOAZF明显降低HG诱导的HUVECs中ROS水平和细胞凋亡率(P<0.05);免疫印迹实验结果和Trx-1活性检测结果显示,与正常组比较,造模组细胞中TXNIP的mRNA和蛋白水平显著上调(P<0.01),Trx-1的活性显著降低(P<0.01);与模型组比较,4μg·L^(-1)EOAZF明显下调HG诱导的TXNIP的mRNA与蛋白的表达上调(P<0.05),同时增强细胞内总Trx-1的酶活活性(P<0.05),发挥抗氧化应激的作用。结论:EOAZF能改善HG诱导损伤的HUVECs的内皮功能,降低细胞内ROS水平和凋亡水平,发挥显著的内皮细胞保护作用,其机制可能是通过降低TXNIP的mRNA和蛋白水平以及增强Trx-1的活性而发挥的抗氧化应激作用。

胡黄连苷 Ⅱ调节TXNIP/NLRP3信号通路对重症肺炎大鼠肺泡上皮细胞焦亡的影响

目的探讨胡黄连苷Ⅱ(picrosideⅡ,PICⅡ)对重症肺炎大鼠肺泡上皮细胞焦亡及硫氧还蛋白相互作用蛋白(thioredoxin-interacting protein,TXNIP)/核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3(nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor protein 3,NLRP3)信号通路的影响。方法构建重症肺炎大鼠模型,将大鼠分为对照组,重症肺炎组,PICⅡ低、中、高剂量组(PICⅡ-L组、PICⅡ-M组、PICⅡ-H组),PICⅡ高剂量+TXNIP/NLRP3通路激活剂氧化三甲胺组(PICⅡ-H+TMAO组)。ELISA法检测肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factorα,TNF-α)、白细胞介素(interleukin,IL)-1β、IL-6水平,瑞氏染色检测肺泡灌洗液沉淀物中嗜酸性粒细胞(eosinophil,EOS)、淋巴细胞(lymphocyte,LYM)、中性粒细胞(neutrophil,NEU)计数;苏木精-伊红染色观察肺组织病理变化,免疫组化检测半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶1(cysteine aspartate protease 1,Caspase-1)、消皮素D(dermatin D,GSDMD)表达,Western blot法检测TXNIP、NLRP3、凋亡相关微粒蛋白(apoptosis-associated microprotein,ASC)表达。结果与对照组相比,重症肺炎组大鼠肺组织损伤严重,炎性细胞浸润明显,TNF-α、IL-1β、IL-6、EOS、LYM、NEU、Caspase-1、GSDMD、TXNIP、NLRP3、ASC表达升高(均P<0.05)。与重症肺炎组相比,PICⅡ-L、PICⅡ-M、PICⅡ-H组大鼠肺组织损伤依次减轻,炎症细胞浸润逐渐减少,TNF-α、IL-1β、IL-6、EOS、LYM、NEU、Caspase-1、GSDMD、TXNIP、NLRP3、ASC表达依次降低(均P<0.05)。与PICⅡ-H组相比,PICⅡ-H+TMAO组大鼠肺组织损伤加重,炎性细胞浸润显著增加,TNF-α、IL-1β、IL-6、EOS、LYM、NEU、Caspase-1、GSDMD、TXNIP、NLRP3、ASC表达升高(均P<0.05)。结论PICⅡ可能通过抑制TXNIP/NLRP3通路抑制重症肺炎大鼠肺泡上皮细胞焦亡。

黄芪甲苷调控细胞焦亡减轻肠缺血再灌注损伤的分子作用机制

目的:采用网络药理学和体内实验结合的方法研究黄芪甲苷(AS-Ⅳ)调控细胞焦亡(Pyroptosis)减轻肠缺血再灌注损伤(IRI)的作用机制。方法:首先从中药系统药理数据库和分析平台(TCMSP)数据库和Swiss Target Prediction数据库中检索获得AS-Ⅳ的对应靶点基因,并从GeneCards数据库中检索得到肠IRI和Pyroptosis相关的靶点基因,通过解螺旋网站绘制Venn图,获得三者的共同靶点基因。通过STRING数据库、Cytoscape软件构建蛋白-蛋白相互作用(PPI)网络筛选共同靶基因并导入Cytoscape软件获得核心靶基因。微生信平台用于基因本体(GO)和京都基因与基因组百科全书(KEGG)富集分析并预测AS-Ⅳ调控Pyroptosis减轻肠IRI的作用机制。然后采用随机数字表法,将C57/BL6J小鼠随机分为5组,正常组、模型组、给药组(IR+AS-Ⅳ)、核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3(NLRP3)激动剂NSS组(IR+AS-Ⅳ+NSS)、NLRP3抑制剂MCC950组(IR+AS-Ⅳ+MCC950)。模型组、给药组、NLRP3激动剂NSS组、NLRP3抑制剂MCC950组采用夹闭肠系膜上动脉45 min恢复灌注2 h建立肠IRI模型,正常组仅分离血管不夹闭。给药组、NLRP3激动剂NSS组、NLRP3抑制剂MCC950组于造模前连续3 d灌胃溶于0.1%二甲基亚砜的黄芪甲苷(50 mg·kg^(-1)),末次灌胃时间为造模前2 h,其余2组灌胃等量的生理盐水。NLRP3激动剂NSS组于造模前1 h腹腔注射4 mg·kg^(-1)的NSS,NLRP3抑制剂MCC950组于造模前1 h腹腔注射10 mg·kg^(-1)的MCC950。再灌注2 h处死小鼠,获取肠组织。采用酶联免疫吸附测定法(ELISA)检测白细胞介素(IL)-18,IL-1β水平,蛋白免疫印迹法(Western blot)检测硫氧还蛋白互作蛋白(TXNIP)、NLRP3、胱天蛋白酶(Caspase)-1、焦孔素D(GSDMD)蛋白表达,Chiu's评分评估小鼠肠组织病理学变化。结果:网络药理学分析表明肠IRI的靶点有1599个,AS-Ⅳ的作用靶点有199个,Pyroptosis的靶点有197个,三者共同靶点有20个。核心靶点有10个,包括NLRP3、TXNIP、沉默信息调节因子1(SIRT1)、高迁移率族蛋白1(HMGB1)、IL-18、GSDMD、基质金属蛋白酶-9(MMP-9)等。共同靶点的KEGG富集筛选出的通路相关性最大的是NOD样受体通路。体内实验结果表明,与正常组比较,模型组Chiu's评分升高,小鼠肠组织IL-18,IL-1β炎症因子水平明显升高(P<0.05),TXNIP、NLRP3、Caspase-1、GSDMD蛋白表达水平明显升高(P<0.05);与模型组比较,给药组和NLRP3抑制剂MCC950组Chiu's评分降低,小鼠肠组织IL-18,IL-1β炎症因子水平明显降低(P<0.05),TXNIP、NLRP3、Caspase-1、GSDMD蛋白表达水平明显降低(P<0.05);与给药组比较,NLRP3激动剂NSS组Chiu's评分升高,小鼠肠组织IL-18,IL-1β炎症因子水平明显升高(P<0.05),NLRP3、Caspase-1、GSDMD蛋白表达水平明显升高(P<0.05);与NLRP3抑制剂MCC950组比较,NLRP3激动剂NSS组Chiu's评分升高,小鼠肠组织IL-18,IL-1β炎症因子水平明显升高(P<0.05),TXNIP、NLRP3、Caspase-1、GSDMD蛋白表达水平明显升高(P<0.05)。结论:网络药理学预测结果与体内实验结果一致,黄芪甲苷通过TXNIP/NLRP3信号通路抑制细胞焦亡以减轻IRI。