拟南芥硫氧还蛋白M1型基因(AtTRX m1)与环境逆境之间的关系

硫氧还蛋白家族是约12 kD的小分子蛋白质,含有高度保守的活性反应位点WCG/PPC,催化硫醇—二硫键相互交换,调节细胞内的氧化还原作用。在本研究中,通过RT-PCR法获得目的基因拟南芥硫氧还蛋白M1型基因 (AtTRX m1, GenBank Accession No. At1g03680)。通过Northern杂交分析拟南芥悬浮细胞系在 100 mmol/L NaCl、10mmol/L NaHCO3、50μmol/L ABA、10mmol/L H2O2 等逆境处理下mRNA表达水平的变化和硫氧还蛋白 M1 型转基因植株对NaCl、NaHCO3盐及ABA逆境的抗性分析,表明硫氧还蛋白M1型基因与生物环境胁迫有一定的相关性,尤其是氧化胁迫,能够增强植物对逆境的耐受力。从而为进一步研究硫氧还蛋白基因家族与逆境之间的相关作用奠定了基础。

丙型肝炎病毒非结构蛋白NS3上调硫氧还蛋白还原酶1基因的表达

目的:探讨丙型肝炎病毒(HCV)非结构蛋白NS3对硫氧还蛋白还原酶1(TXNRD1)启动子转录的激活作用. 方法:以HCV非结构蛋白NS3反式调节基因的基因表达谱芯片结果为基础,利用生物信息学技术确定TXNRD1的启动子区域(TXNRD1p),聚合酶链反应(PCR)扩增TXNRD1p, 克隆至真核报告载体pCAT3-Basic中,构建pCAT3- TXNRD1p报告载体;以该质粒转染肝癌细胞系HepG2细胞系,用酶联免疫黏附法(ELISA)检测氯霉素乙酰转移酶(CAT)的表达活性;并与pcDNA3.1(-)-NS3共转染HepG2 细胞系,用ELISA法检测CAT的表达活性. 结果:成功获得TXNRD1启动子的正确克隆CATB-TXNRD1p 和pcDNA3.1(-)-NS3瞬时转染的HepG2细胞的CAT表达活性是pCAT3-Basic空载体的9倍,pCAT3-TXNRD1p的2.0倍,进一步验证了利用基因表达谱技术研究HCV NS3 蛋白反式激活作用的结果. 结论:TXNRD1启动子有顺式激活下游基因的活性;HCV的NS3蛋白具有对TXNRD1的反式激活作用.

丙型肝炎病毒非结构蛋白NS5A上调硫氧还蛋白还原酶1基因表达的研究

目的探讨丙型肝炎病毒(HCV)非结构蛋白NS5A对硫氧还蛋白还原酶1(TXNRD1)启动子转录的激活作用。方法以我室构建的丙型肝炎病毒非结构蛋白NS5A反式调节基因的cDNA文库抑制性消减杂交(SSH)筛选结果及基因表达谱芯片结果为基础,利用生物信息学技术确定TXNRD1的启动子区域(TXNRD1p),聚合酶链反应(PCR)扩增TXNRD1p,克隆至真核报告载体pCAT3_Basic中,构建pCAT3_TXNRD1p报告载体;以该质粒转染肝癌细胞系HepG2,用酶联免疫吸附法(ELISA)检测氯霉素乙酰转移酶(CAT)的表达活性;并与pcDNA3.1(-)_NS5A共转染HepG2细胞系,用ELISA法检测CAT的表达活性。结果pCAT3_TXNRD1p和pcDNA3.1(-)_NS5A瞬时转染的HepG2细胞的CAT表达活性是pCAT3_Basic空载体的9.6倍,pCAT3_TXNRD1p的2.1倍。本实验进一步验证了我室利用SSH技术及基因表达谱技术发现的HCVNS5A蛋白反式激活TXNRDl基因转录作用的结果。结论我室克隆的TXNRD1启动子有顺式激活下游基因的活性;HCV的NS5A蛋白具有对TXNRD1基因启动子的反式激活作用。

谷氧还蛋白1和硫氧还蛋白1基因在云南乌金猪不同组织中的表达特点及L-组氨酸对其在氧化应激细胞中表达的影响

本试验旨在研究抗氧化基因谷氧还蛋白1(GRX1)、硫氧还蛋白1(TRX1)在云南乌金猪脑垂体、下丘脑、甲状腺、胸腺、胰腺、生殖腺、肝脏、皮肤、十二指肠、空肠、回肠11种组织中的差异表达,探讨L-组氨酸对乌金猪氧化应激细胞中GRX1、TRX1基因表达的调节作用。采用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)方法检测乌金猪组织中GRX1、TRX1基因表达;以过氧化氢(H2O2)为氧化应激源建立氧化应激细胞模型,探讨L-组氨酸对GRX1、TRX1基因表达的调节作用。结果表明:1)GRX1、TRX1基因在乌金猪被检测组织中均有表达,肝脏表达量最高,其次是皮肤、空肠,其他组织中的表达量相对较低;2)乌金猪组织中TRX1基因表达量明显高于G RX1基因表达量;3)细胞培养结果表明,受到H2O2刺激时,氧化应激细胞中GRX1、TRX1基因产生过表达,L-组氨酸对氧化应激细胞或非应激细胞中GRX1、TRX1基因表达具有调节作用,其适宜浓度约为280μg/mL。乌金猪GRX1、TRX1基因表达具有明显组织特异性,H2O2可诱导氧化应激细胞中GRX1、TRX1基因产生过表达,添加适宜浓度的L-组氨酸可以调节氧化应激细胞或非应激细胞中GRX1、TRX1基因表达。结果提示,通过营养途径可诱导乌金猪体内G RX1、TRX1基因的表达,这是缓解机体氧化应激损伤和增强抗氧化能力的一种有效方式。

胸腺素α_1-硫氧还蛋白融合蛋白基因的表达及其生物学功能的初步研究

胸腺素α1(thymosinalpha 1,Tα1)作为一种免疫增强剂 ,临床用途广泛。为了大量制备Tα1,按大肠杆菌惯用密码子用人工方法合成Tα1基因 ,克隆于 pUC19的EcoRI和PstI位点 ,经测序证明序列正确后 ,串联为 4串体 (Tα1④ ) ,经再次测序确认后克隆入 pThioHisA的EcoRI和PstI位点 ,转化大肠杆菌TOP10菌种 ,酶切鉴定证明正确后 ,经 1mmol/LIPTG诱导 4h ,获得硫氧还蛋白与Tα1④的融合表达 ,并经Westernblot分析证实。用离子交换柱层析可纯化出硫氧还蛋白与Tα1④的融合蛋白 ,利用3H -TdR掺入法证实 ,该融合蛋白具有刺激小鼠脾淋巴细胞的活性。

切除修复交叉互补基因1、核糖核苷酸还原酶M1亚基和3型β微管蛋白分子检测指导晚期非小细胞肺癌个体化治疗的临床效果

目的探讨切除修复交叉互补基因1（ERCC1）、核糖核苷酸还原酶M1亚基（RRMl）和3型β微管蛋白（TUBB3）分子检测在指导晚期非小细胞肺癌（NSCLC）个体化治疗的临床效果。方法将2013年1～11月秦皇岛市第二医院胸外科住院治疗的48例经病理确诊的晚期NSCLC患者分为实验组（20例）和对照组（28例）。实验组采用SYBR荧光实时定量PCR检测方法检测患者胸水或静脉血中ERCC1、RRM1和TUBB3的表达量，根据表达情况选择化疗方案：对照组则均采用顺铂与吉西他滨联合治疗。经过2个周期治疗后比较两组的疗效、不良反应及疾病进展、生存获益情况。结果实验组的总有效率和总控制率均显著高于对照组（P〈0．05）；实验组和对照组治疗后的PS评分均显著高于治疗前（P〈0．05），但两组治疗后的PS评分、PS评分改善率差异均无统计学意义（P〉0．05）；两组间不良反应发生率差异无统计学意义（P〉0．05），且两组间不同系统的不良反应严重程度差异均无统计学意义（P〉0．05）。结论实时定量PCR技术检测病理组织的ERCC1、RRM1和TUBB3表达水平用于指导晚期NSCLC患者个体化治疗，可提高治疗有效率和疾病控制率，但在改善生活质量和减少不良反应发生效果不显著．建议进一步探索标志物指导下更为有效的化疗方案。

谷胱甘肽转硫酶T1、M1基因型和烟酒茶嗜好与食管癌、胃癌

目的 :研究谷胱甘肽转硫酶T1、M1(GSTT1、GSTM 1)基因多态性和烟酒茶嗜好及其相互作用与食管癌、胃癌易感性的关系。方法 :在上消化道癌高发区淮安市进行了病例 -对照研究 (食管癌 141例 ,胃癌 15 3例 ;人群对照 2 2 3例 ) ,调查研究对象的烟酒茶嗜好习惯 ,以多重PCR方法分析GSTT1、GSTM1基因型。结果 :食管癌组GSTM1-基因型频度 (75 .18% )显著高于对照组 (5 9.6 4 % ,P =0 .0 0 2 4 ;多因素调整OR =2 .33,95 %CI =1.39～ 3.92 )。吸烟或不饮茶与GSTM 1 基因型在增加食管癌发生的风险中有明显的协同作用。在GSTT1+基因型者中 ,吸烟习惯显著增加食管癌、胃癌的危险性 ;在GSTM1+基因型者中 ,经常饮酒显著增加食管癌、胃癌的危险性。结论 :食管癌、胃癌的发生与生活习惯、GSTM1和GSTT1基因型以及它们的相互作用有关。

谷胱甘肽转硫酶M1和T1基因型与新疆哈萨克族食管癌的关系

目的 为探讨与致癌物代谢有关的谷胱甘肽转硫酶 (GST) T1和 M1基因多型性与哈萨克族食管癌易感性的关系。方法 采用聚合酶链 (PCR)技术 ,分析新疆食管癌高发民族中 GSTM1和 GSTT1基因型分布的差异。结果 GSTM1基因在食管癌、癌旁正常粘膜对照组中缺失率分别为 4 1.4 6 % (17/ 4 1)、34.15 % (14 / 4 1) ;GSTT1基因缺失率的分别为 4 8.78% (2 0 / 4 1)、5 1.2 2 % (2 1/4 1) ,差别均无显著性。同时 ,在食管癌组织的高分化组、中低分化组中 GSTT1和 GSTM1基因缺失率分别为 6 1.5 4 % (8/ 13)、4 2 .86 % (12 / 2 8)、15 .38% (2 / 13)、5 3.5 7% (14 / 2 8) ,其中 GSTM1基因缺失率在高、中低分化组中差别有统计学意义。结论 提示

散发性大肠癌和谷胱甘肽转硫酶M1基因型的关系

目的:探讨散发性大肠癌(SCRAC)和谷胱甘肽转硫酶(GST)M1基因多态性的关系。方法:采用聚合酶链反应技术(PCR)检测112例SCRAC患者和140例健康对照的GSTMl基因型,采用x^2检验,分析比较GSTM1基因型频率在SCRAC组和健康对照组之间的分布差异。结果:GSTMl(-)基因型频率在SCRAC组中明显增高,与对照组相比,差异有统计学意义(60.8%vs45.0%,P=0.019,OR=1.820,95%CI:1.100～3.011);根据临床特征对大肠癌组进行分层分析,发现GSTM1(-)基因型与大肠癌病变部位无关(P>0.05),但在Dukes C期和低分化腺癌患者中分布频率明显增高(P=0.018,OR=3.250,95%CI:1.188～8.892;P=0.005,OR=0.324,95%CI:0.146～0.719)。结论:GSTM1基因多态性与SCRAC易感性明显相关。

在INS-1细胞中构建胰腺组织硫氧还蛋白相互作用蛋白过表达模型:两种腺病毒感染方法的差异

背景:目前,通过腺病毒感染方法在细胞中构建蛋白质过表达模型的方法主要有2种,一是在腺病毒感染细胞4 h后补充1640完全培养基,24 h后换为完全培养基,再继续培养到48 h(方法Ⅰ);另一种是在腺病毒感染细胞4 h后用PBS洗去含有腺病毒的1640培养基,更换4 mL完全培养基培养到48 h,中间不做任何处理(方法Ⅱ)。前者病毒的作用时间较长,感染效果较好,但病毒本身对细胞的损害程度较大,对实验模型的稳定性产生干扰。而后者病毒的作用时间短,对细胞的毒性低,但有时病毒感染效率较低,目的蛋白的表达效果欠佳。目的:在大鼠INS-1胰岛β细胞中,通过比较相同腺病毒载体介导的不同感染细胞的方法而寻找一种更加稳定而高效的硫氧还蛋白相互作用蛋白(Thioredoxin-interacting protein,TXNIP)过表达模型。方法:构建含有绿色荧光蛋白的腺病毒载体(Ad-GFP)和TXNIP过表达腺病毒载体(Ad-TXNIP-GFP)。分别设立正常组、空病毒组和TXNIP过表达组,按照上述2种不同的方法进行病毒转染。结果与结论:(1)方法Ⅱ中的绿色荧光蛋白荧光强度和阳性效率高于方法Ⅰ;(2)方法Ⅱ中的细胞形态更好且细胞存活率更高;(3)方法Ⅱ中,目的基因TXNIP在mR NA水平和蛋白质水平的表达情况明显高于方法Ⅰ。由以上结果得出结论,腺病毒感染INS-1细胞4 h后,使用PBS将旧培养基洗去并更换新培养基,继续培养到48 h的方法更有利于在INS-1细胞中构建TXNIP过表达模型。

低硒大鼠心肌线粒体型硫氧还蛋白还原酶的活性和表达

目的探讨低硒状态下大鼠心肌线粒体型硫氧还蛋白还原酶(TR2)的活性和表达变化,分析体内硒水平改变对TR2活性的影响及其可能的机制。方法用低硒饲料喂养断乳2周的Wistar大鼠14周,分别采用生物化学方法、Western blot和Northern blot杂交检测心肌组织中TR2的活性改变及TR2蛋白、基因表达变化。结果低硒组大鼠心肌TR2活性降低至对照组的69.3%,差异有非常显著意义。蛋白杂交的峰面积密度扫描结果显示,常硒组为3 538,低硒组为2 167。Northern blot结果显示,低硒组与对照组差异无显著意义。结论低硒能够降低心肌TR2的活性和蛋白表达水平,但并不影响此酶的基因表达。提示低硒导致心肌TR2活性降低可能是由于TR2蛋白合成过程中SeCys插入减少所致。

m型硫氧还蛋白对马铃薯Y病毒侵染烟草的影响

为进一步明确病毒与寄主间的相互作用关系,通过同源比对在烟草细胞中克隆到具有m型硫氧还蛋白(m-type thioredoxin)特征的基因,暂命名为Nt Trm。利用原生质体瞬时转化技术、病毒诱导的基因沉默技术(VIGS)、半定量-PCR以及Northern blot检测技术研究Nt Trm的表达以及Nt Trm表达与PVY积累的关系。结果表明,在PVY接种10 d后红花大金元叶片中Nt Trm表达明显上调;在本氏烟草叶片中Nt Trm下调显著促进了PVY在烟草叶片中的积累;而在烟草原生质体中Nt Trm过量表达则会明显抑制病毒RNA的积累。初步说明烟草细胞内编码m型硫氧还蛋白的基因受PVY侵染而被诱导表达,这类基因的上调表达可能影响PVY在烟草细胞中的侵染。

中国广东潮汕地区汉族人对氧磷脂酶1(PoN1)L55M基因多态性与冠心病伴高血糖的关系

目的观察广东省潮汕地区汉族人群对氧磷脂酶1(PON1)L55M基因多态性与冠心病(CHD)合并空腹血糖升高(FHG)及2型糖尿病(T2DM)的相关关系,及与冠状动脉血管病变数和病变范围的相关关系。方法284例受检者据空腹血糖和冠状动脉造影结果分正常对照组(90例)、CHD组(86例)、CHD+FHG组(62例)、CHD+T2DM组(46例),进行SNPs序列测定入选人群PON1L55M基因并分析。结果广东地区汉族人群PON1L55M基因存在多态性,L等位基因频率为0.86。3种基因型(LL,LM,MM)在4组中无明显差异。L等位基因在冠心病病变血管数目和病变范围中无明显差异(χ2=0.56,P=0.758;χ2=0.11,P=0.743)。结论中国广东潮汕地区汉族人群中存在PON1L55M基因多态性,等位基因频率以L型为主。PON1L55M基因多态性与是否发生空腹血糖升高或糖尿病以及冠状动脉病变严重程度无明显相关性。

介导入硫氧还蛋白基因转移的重组腺病毒构建

目的 应用基因重组方法构建携带人硫氧还蛋白（hTRX）基因的复制缺陷型重组腺病毒。方法 用内切酶、RT-PCR、测序方法获得目的基因片段，然后将其cDNA克隆至表达载体pShuttle构建hTRX的重组真核细胞表达载体pShuttle—hTRX，在HeLa细胞中进行瞬时表达检测。从真核表达载体pShuttle—hTRX切下目的基因，并插入至腺病毒载体构建hTRX的重组腺病毒载体Adeno—hTRX，经PCR方法亦证明了成功构建腺病毒重组体。重组腺病毒在293细胞中扩增、纯化。结果 成功构建了携带人硫氧还蛋白基因的复制缺陷型重组腺病毒，并以多种方法证实了构建载体的正确性。结论 正确构建的人硫氧还蛋白重组腺病毒载体，可为基因治疗心血管系统疾病打下良好基础。

云南籍正常人群和肺癌人群GSTM1基因型多态性的比较研究

实验采用聚合酶链式反应 ( Polymerase Chain Reaction,PCR)技术对云南籍正常人群和肺癌人群的 GSTM1基因型多态性进行了检测。GSTM1基因纯合缺失 ( GSTM1 0 /0 )在正常人群中的分布频率为 65 .8% ( n =99) ,而在肺癌人群中分布频率为 76.8% ( n =5 6)。结果表明 GSTM1基因型多态性在云南籍正常人群和肺癌人群中的分布频率无显著性差异。

硫氧还蛋白还原酶1(TrxR1)在胃癌中的表达及对胃癌细胞生长的影响

目的:探讨胃癌组织硫氧还蛋白还原酶1(TrxR1)表达与生存时间的关系及其对胃癌细胞生长的影响。方法:用Real-time PCR法检测76例胃癌组织及癌旁TrxR1 mRNA表达,并分析其与胃癌患者临床病理特征及预后的关系;随机选取3例胃癌组织及癌旁组织,采用免疫组化法、Western blot法检测TrxR1蛋白表达。采用Western blot法和Real-time PCR法检测胃癌细胞系及人胃粘膜上皮细胞中TrxR1的表达。采用小RNA干扰序列(siRNA)处理AGS细胞,根据处理方法不同将AGS细胞分为3组:阴性对照组:转染NC-siRNA、TRXR1 siRNA干扰1组:转染TRXR1-siRNA1、TRXR1 siRNA干扰2组:转染TRXR1-siRNA2。使用Real-time PCR法检测各组AGS细胞中TrxR1 mRNA的表达,克隆形成试验和MTT法检测AGS细胞生长情况。结果:胃癌组织中TrxR1 mRNA和蛋白表达量均显著性上调,TrxR1主要定位于细胞质中。TrxR1高表达与患者TNM分期及淋巴结转移有关,且TrxR1高表达组患者的中位生存时间短于低表达组(P<0.05)。胃癌细胞中TrxR1表达量高于人胃粘膜上皮细胞系中的表达。TRXR1-siRNA1组AGS细胞和TRXR1-siRNA2组AGS细胞中TrxR1 mRNA和蛋白与NC-siRNA组相比均显著性降低(P<0.05),且AGS细胞克隆形成与增殖能力均降低(P<0.05)。结论:胃癌组织中TrxR1高表达提示患者预后不良,沉默TrxR1能抑制胃癌细胞的增殖。

甜菜M14品系BvM14-Tpx基因克隆及原核表达体系下应答氧化胁迫功能的初步研究

为了研究甜菜M14品系BvM14-Tpx基因的抗氧化功能,本试验以带有野生白花甜菜第9号染色体的单体附加系M14品系为试验材料,利用RACE技术获得甜菜M14品系硫氧还蛋白过氧化物酶基因(BvM14-Tpx) cDNA全长,对其进行生物信息学分析,利用Real-time PCR和半定量RT-PCR技术对该基因进行组织特异性表达分析,在原核表达体系下进行BvM14-Tpx基因应答氧化胁迫研究。生物信息学分析结果表明,BvM14-Tpx基因cDNA全长为1044 bp,包含最大的ORF为489 bp,编码162个氨基酸;含有过氧化物酶Ⅱ(PrxⅡ)型的保守结构域;BvM14-Tpx蛋白与豌豆(Pisum sativum L.)和苜蓿(Medicago truncatula L.)中Tpx蛋白的亲缘性较高。组织特异性表达分析结果表明,BvM14-Tpx基因在甜菜M14品系各组织表达量从高到低的顺序是根、茎、叶、花。通过原核表达体系下BvM14-Tpx基因应答氧化胁迫的研究,表明BvM14-Tpx基因能够提高大肠杆菌对于环境中氧化胁迫的适应能力,减轻H2O2对细菌生长的抑制。本研究对挖掘甜菜M14品系优质基因,提高甜菜对于非生物胁迫的抗性以及开展甜菜遗传改良工作具有重要意义。

硫氧还蛋白还原酶1及其相关信号通路研究进展

硫氧还蛋白还原酶1(thioredoxin reductase 1,TrxR1)是维持机体稳态重要屏障的抗氧化系统成员。近年来,TrxR1相关信号通路的研究逐步受到关注。因此,本文将从硫氧还蛋白系统着手,对TrxR1及其相关信号通路的研究进展进行阐述,以期为TrxR1在疾病中的作用机制阐明提供新思路。

急性白血病患者WT1、PRAME、ERG、TRX-2基因表达的检测及其与疾病分型、疗效的关系

目的:研究急性白血病患者肾母细胞瘤基因(WT1)、黑色素瘤优先表达抗原(PRAME)、ETS相关基因(ERG)、硫氧还蛋白-2(TRX-2)基因表达及其与疾病分型、疗效的关系。方法:将本院收治的90例白血病患者纳入研究的白血病组,将同期体检健康者纳入健康组;进一步根据分型将白血病患者分为ALL组和AML组,根据化疗后疗效将白血病患者分为完全缓解组和复发组。采集患者的外周血,检测WT1、PRAME、ERG、TRX-2基因的mRNA含量。结果:白血病组血液中WT1、PRAME、ERG、TRX-2基因的mRNA含量高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05);AML组血液中WT1、PRAME、ERG、TRX-2基因的mRNA含量高于ALL组,差异有统计学意义(P<0.05);复发组的血液中WT1、PRAME、ERG、TRX-2基因的mRNA含量高于完全缓解组,差异有统计学意义(P<0.05)。结论:WT1、PRAME、ERG、TRX-2基因异常高表达与白细胞的发生有关,也与疾病的分型、化疗的效果密切相关。

甘蓝自交不亲和信号传导中SRK结合蛋白基因THL1的克隆与序列分析

采用PCR和RT PCR技术 ,从甘蓝基因组和柱头总RNA中扩增获得了 719bp的硫氧还蛋白(THL1)的全长基因序列和 4 30bp的cDNA序列。序列分析首次表明 ,克隆的THL1基因全序列有两个内含子 ,cDNA序列编码