转TRXS基因啤酒大麦种子中硫氧还蛋白H与淀粉酶活性变化

导入TRXS基因后,转基因大麦籽粒的硫氧还蛋白H活性明显提高;淀粉酶活性也明显提高,其中Α-淀粉酶活性在开花后30D提高了3倍以上,随着籽粒的发育,转基因对Α-淀粉酶活性影响作用减少,对Β-淀粉酶活性的影响有同样的趋势;转基因大麦种子发芽势明显提高。说明TRXS基因有望改善啤酒大麦的制麦特性和品质特性。

反义TRX s基因对转基因小麦籽粒硫氧还蛋白还原活性的影响

以转反义TRX s基因小麦纯合系为材料,分析了转基因小麦TRX h活性和清蛋白、球蛋白、谷蛋白和麦醇溶蛋白各组分及其还原状态的变化。结果表明,不同成熟期转基因小麦籽粒和胚乳中TRX h活性平均比对照降低76.2%和14.2%,其籽粒中的清蛋白、球蛋白、麦醇溶蛋白和谷蛋白巯基含量平均比对照分别低41%、44%、14%和13%,胚乳中分别比对照低37%、17%、45%和6%,而不同成熟期转基因小麦籽粒和胚乳中4种蛋白组分含量比对照都相应提高。说明导入的反义TRX s基因对小麦TRX h基因表达有显著(P<0.05)的抑制作用,进而影响TRX h对各蛋白组分的还原作用,造成还原态蛋白组分(巯基含量)降低,被动员消耗的蛋白质数量减少,而各蛋白组分含量显著(P<0.05)高于对照。本研究结果为转反义TRX s基因小麦种子发芽延缓和抗穗发芽特性提供了直接的证据。

甘蔗硫氧还蛋白基因ScTRXh1的克隆及表达特性分析

硫氧还蛋白(thioredoxin,TRX)家族是一类古老的小分子蛋白,已被证明在维持生物体内氧化还原平衡、调控生物信号传导和应答多种非生物逆境胁迫中起重要作用。本研究从甘蔗(Saccharumcomplex)茎全长cDNA文库中分离克隆了一个甘蔗硫氧还蛋白h型基因的cDNA全长序列,命名为ScTRXh1。ScTRXh1全长786bp,5'非翻译区长96bp,3'非翻译区长306bp,开放读码框长384bp,共编码127个氨基酸。实时荧光定量PCR分析表明,甘蔗中ScTRXh1基因的表达在处理前期分别受到ABA的抑制和H2O2的促进;PEG和NaCl胁迫处理对ScTRXh1基因表达的影响不显著;甘蔗中ScTRXh1基因的表达受SA的诱导而显著上调,其表达丰度在处理周期内维持在对照的6倍以上。以上结果表明ScTRXh1基因参与了甘蔗对SA、ABA和氧化胁迫等逆境因子的应答过程。甘蔗不同组织器官的定量表达结果分析表明,ScTRXh1基因在甘蔗根、茎和芽中的相对表达丰度高,分别是其在叶中的33倍、17倍和12倍以上。本研究结果为后续TRX基因在甘蔗抗逆相关机理研究和抗逆育种中的应用奠定了基础。

应答非生物胁迫的甘蔗硫氧还蛋白基因ScTRXh2的克隆

从甘蔗蔗茎cDNA文库中获得1个TRXⅠ类第3亚组成员的硫氧还蛋白家族基因全长cDNA序列,命名为ScTRXh2(登录号:KF921298).该基因全长752 bp,开放阅读框长381 bp,5'非翻译区长57 bp,3'非翻译区长314 bp,编码126个氨基酸残基,氨基酸序列与拟南芥TRXs具有高度同源性.实时定量PCR检测显示,该基因在甘蔗中为组成型表达,叶片和蔗茎中的表达量显著高于根和芽.在H2O2和PEG逆境胁迫下,甘蔗ScTRXh2基因的应答模式基本相同,呈现初期(3 h)略微下调,早中期(6 h或12 h)表达量明显上调,中后期(24、48、72 h)显著下调并维持基本稳定的低水平表达.甘蔗ScTRXh2基因对NaCl胁迫的应答较快,虽然也呈现中期(12 h)表达量显著上调,后期(24、48、72 h)显著下调并维持基本稳定的低水平表达,但表达模式与H2O2和PEG胁迫应答有明显不同,表现在胁迫初期(3 h)基因表达显著下调.上述结果提示,甘蔗ScTRXh2基因积极应答非生物逆境H2O2、PEG和NaCl的胁迫,在应答的基因表达谱模式上存在一些差异.

沙雷氏菌CM01来源硫氧还蛋白的抗铬(VI)能力研究

目的:通过克隆Serratia sp. M01中的硫氧还蛋白编码基因trxA、trxC,构建原核表达载体并转化至E. coli BL21(DE3)中,探究工程菌的抗铬(VI)能力。方法:以Serratia sp. CM01的DNA作模板,采用PCR扩增trxA、trxC基因,构建表达载体pET-28a(+)-trxA、pET-28a(+)-trxC并转化至E. coli BL21(DE3)表达以构建工程菌。以测定工程菌的Cr(VI)耐受、生长曲线,确定工程菌的抗Cr(VI)能力。结果:利用基因克隆技术,成功构建出trxA、trxC工程菌。测定两种工程菌的生长情况,发现在无Cr(VI)条件下,三种工程菌生长曲线没有差异(P > 0.05)。在Cr(VI)的胁迫下,两种工程菌在稳定期的菌量为:Serratia sp. CM01 > trxA ≈ trxC > Control (P trxA > trxC > Control (P < 0.05)。结论:trxA、trxC基因编码的蛋白均具备的耐受Cr(VI)能力,工程菌trxA抗Cr(VI)能力强于trxC,工程菌具有治理实际环境中Cr(VI)污染的潜力。

青蛤(Cyclina sinensis)金属硫蛋白及硫氧还蛋白基因的克隆与表达分析

利用构建的cDNA文库及高通量测序方法,获得金属硫蛋白及硫氧还蛋白基因全长。结果表明,青蛤金属硫蛋白和硫氧还蛋白的cDNA全长分别为776bp和804bp,金属硫蛋白基因编码74个氨基酸,包含7个CXC特征结构;硫氧还蛋白基因编码165氨基酸,包含5个氨基酸构成的活性中心。采用实时定量PCR方法分析了两种基因在Cd2+胁迫下的表达变化,结果显示,金属硫蛋白基因在Cd2+胁迫下6—12hmRNA表达量急剧上升,与对照组有显著性差异(P<0.01)。硫氧还蛋白基因在Cd2+胁迫下mRNA在6h明显升高,在6—24h与对照组出现显著性差异(P<0.05)。说明Cd2+能够诱导青蛤金属硫蛋白和硫氧还蛋白基因表达的时序性升高,二者的转录过程反映了贝类抵御重金属胁迫的分子调控过程。

甜橙硫氧还蛋白基因CsTRXh1克隆与表达分析

[目的]通过甜橙硫氧还蛋白基因CsTRXh1克隆与表达分析,以期为解析甜橙硫氧还蛋白基因的功能及胁迫应答机制提供参考依据。[方法]基于甜橙基因组数据使用同源克隆法克隆甜橙硫氧还蛋白基因,利用生物信息学分析CsTRXh1蛋白与其他物种同源蛋白的相似性、系统进化和理化性质,使用qRT-PCR方法分析CsTRXh1基因在健康甜橙树和感染黄龙病甜橙树叶片中的表达模式,通过瞬时转化烟草叶片分析CsTRXh1蛋白在植物细胞中的亚细胞定位。[结果]获得1个甜橙硫氧还蛋白基因CsTRXh1,GenBank登录号为ON125405。蛋白质序列比对分析表明,CsTRXh1与其他植物来源的硫氧还蛋白具有较高的序列相似度,包含保守结构域Thioredoxin。聚类分析表明,CsTRXh1为h型硫氧还蛋白。表达分析结果表明,CsTRXh1基因在感染黄龙病甜橙叶片中上调表达。亚细胞定位分析表明,CsTRXh1定位于细胞质和细胞膜。[结论]CsTRXh1基因受黄龙病菌侵染诱导表达,推测CsTRXh1在黄龙病菌侵染柑橘过程中参与生理生化调控功能。

拟南芥硫氧还蛋白M1型基因(AtTRX m1)与环境逆境之间的关系

硫氧还蛋白家族是约12 kD的小分子蛋白质,含有高度保守的活性反应位点WCG/PPC,催化硫醇—二硫键相互交换,调节细胞内的氧化还原作用。在本研究中,通过RT-PCR法获得目的基因拟南芥硫氧还蛋白M1型基因 (AtTRX m1, GenBank Accession No. At1g03680)。通过Northern杂交分析拟南芥悬浮细胞系在 100 mmol/L NaCl、10mmol/L NaHCO3、50μmol/L ABA、10mmol/L H2O2 等逆境处理下mRNA表达水平的变化和硫氧还蛋白 M1 型转基因植株对NaCl、NaHCO3盐及ABA逆境的抗性分析,表明硫氧还蛋白M1型基因与生物环境胁迫有一定的相关性,尤其是氧化胁迫,能够增强植物对逆境的耐受力。从而为进一步研究硫氧还蛋白基因家族与逆境之间的相关作用奠定了基础。

海洋球石藻(Emiliania huxleyi)病毒硫氧还蛋白(TRX)基因的克隆及生物信息学分析

首次从海洋球石藻病毒(Emiliania huxleyi virus-EhV99B1)中克隆了硫氧还蛋白(Trx)基因(该序列已提交GenBank,登录号:GU109280)。系统进化关系分析表明:EhV99B1-Trx与GenBank中已报道的EhV86-Trx(NC_007346)有很高的同源性,核酸及其推导的氨基酸序列的同源性分别为98%和100%,而与其它物种的Trx序列同源性仅为9.8%-18.8%。采用生物信息学方法和工具分析了EhV99B1-Trx的生化参数,预测了该蛋白的高级结构。结果表明:(1)EhV99B1-Trx基因的开放阅读框全长591bp,编码196个氨基酸,蛋白的相对分子量为22.1kDa,理论等电点为5.27;(2)EhV-99B1-Trx N端蛋白结构域具有保守的Cys-Gly-Pro-Cys(CGPC)硫氧还蛋白氧化还原活性位点氨基酸基序;(3)对该蛋白二、三级结构分析预测结果进一步证实EhV99B1-Trx基因编码的为一种新型的硫氧还蛋白家族成员。

生长抑素(SS)与硫氧还原蛋白(Thioredoxin)相融合生成的2种基因工程化融合蛋白SS-N/X和SS-N/S的表达特性

对基因工程化生长抑素 (som atostatin,SS) -硫氧还原蛋白 (Thioredoxin)融合蛋白 SS- N/ X和 SS- N/ S的表达产量、水溶性、Triton X- 10 0对 SS融合蛋白水溶性的影响、包涵体的溶解和复性特点以及 SS的抗原性与免疫原性等特性进行了研究。结果显示 ,在 30℃的低温下用 IPTG诱导表达 ,SS- N/ X融合蛋白主要以可溶性形式存在 ,占 75 .8% ,包涵体仅占 2 4 .2 % ;而 SS- N/ S融合蛋白则主要以包涵体的形式存在 ,占 81.1% ,可溶性蛋白仅占 18.9% ;32 C载体(p ET- 32 C)蛋白则居二者之间 ,可溶性蛋白与包涵体大约等比例出现。SS- N/ S在低温下诱导可超量表达 SS融合蛋白 ,其表达量约占菌体总蛋白的 4 0 .94 %。 0 .5 % Triton X- 10 0对融合蛋白的水溶性有非常显著的影响 ,几乎可使所有的 SS- N/ X融合蛋白和大部分 SS- N/ S融合蛋白及 32 C硫氧还原蛋白变成水溶性的。 32 C硫氧还原蛋白包涵体在尿素中的溶解度明显高于 SS- N/ S包涵体 ,2 mol/ L尿素可使近一半的 32 C硫氧还原蛋白包涵体溶解 ,而 SS- N/ S包涵体只有 2 7.5 %溶解 ;但在 5 mol/ L 尿素时 ,两者均可基本全部变为可溶性的。在 SS融合蛋白包涵体溶解时加入还原剂二硫苏糖醇 ,可明显降低 SS的抗原性。 SS融合蛋白

铁皮石斛硫氧还蛋白基因(DoTrxL2)的克隆及表达分析

运用c DNA末端快速扩增技术(RACE)和巢式PCR技术克隆出铁皮石斛硫氧还蛋白超家族基因(Thioredoxin like 2,DoTrxL2)。序列分析表明DoTrxL2基因开放阅读框(ORF)长度为639 bp,编码213个氨基酸,编码产物含有一个硫氧还蛋白家族保守的CXXC功能结构域,通过两个半胱氨酸的双硫键得失电子,起到氧化还原作用。分子进化分析显示,DoTrxL2同小兰屿蝴蝶兰、石刁柏亲缘关系较近。qRT-PCR分析显示,DoTrxL2在铁皮石斛原球茎不同发育时期及不同组织中均有表达差异,其中在原球茎形成早期表达量较高,表明该基因对原球茎形成有着促进作用;而在种子和花中表达量高,表明该基因对植物组织的生殖发育具有重要调控作用。

丙型肝炎病毒非结构蛋白NS3上调硫氧还蛋白还原酶1基因的表达

目的:探讨丙型肝炎病毒(HCV)非结构蛋白NS3对硫氧还蛋白还原酶1(TXNRD1)启动子转录的激活作用. 方法:以HCV非结构蛋白NS3反式调节基因的基因表达谱芯片结果为基础,利用生物信息学技术确定TXNRD1的启动子区域(TXNRD1p),聚合酶链反应(PCR)扩增TXNRD1p, 克隆至真核报告载体pCAT3-Basic中,构建pCAT3- TXNRD1p报告载体;以该质粒转染肝癌细胞系HepG2细胞系,用酶联免疫黏附法(ELISA)检测氯霉素乙酰转移酶(CAT)的表达活性;并与pcDNA3.1(-)-NS3共转染HepG2 细胞系,用ELISA法检测CAT的表达活性. 结果:成功获得TXNRD1启动子的正确克隆CATB-TXNRD1p 和pcDNA3.1(-)-NS3瞬时转染的HepG2细胞的CAT表达活性是pCAT3-Basic空载体的9倍,pCAT3-TXNRD1p的2.0倍,进一步验证了利用基因表达谱技术研究HCV NS3 蛋白反式激活作用的结果. 结论:TXNRD1启动子有顺式激活下游基因的活性;HCV的NS3蛋白具有对TXNRD1的反式激活作用.

人硫氧还蛋白基因真核表达载体的构建及其在COS-7细胞中的表达

目的克隆人硫氧还蛋白(hTRX)cDNA序列,进行真核表达载体的构建。方法应用RT-PCR技术,以胎肝组织细胞总RNA为模板,扩增出hTRX成熟蛋白的cDNA基因,并克隆至pUCm-T载体中,经PCR和测序鉴定正确后,再构建重组真核表达载体pcDNA3.0-hTRX,采用PCR、双酶切和基因测序鉴定;利用阳性脂质体Lipofectamine将其转入COS-7细胞(瞬时表达细胞),RT-PCR检测其表达情况。结果将所得序列与GenBank(J04026)提供的序列比较,其酶活性中心(Trp-Cys-Gly-Pro-Cys)和基序与已知序列一致;PCR、酶切及测序鉴定表明真核表达载体构建正确;COS-7细胞中有hTRX的表达。结论成功克隆编码hTRX成熟蛋白的cDNA基因,构建其真核表达载体pcDNA3.0-hTRX,并在COS-7细胞中得到了表达,为进一步探讨hTRX的生物活性和应用奠定了基础。

丙型肝炎病毒非结构蛋白NS5A上调硫氧还蛋白还原酶1基因表达的研究

目的探讨丙型肝炎病毒(HCV)非结构蛋白NS5A对硫氧还蛋白还原酶1(TXNRD1)启动子转录的激活作用。方法以我室构建的丙型肝炎病毒非结构蛋白NS5A反式调节基因的cDNA文库抑制性消减杂交(SSH)筛选结果及基因表达谱芯片结果为基础,利用生物信息学技术确定TXNRD1的启动子区域(TXNRD1p),聚合酶链反应(PCR)扩增TXNRD1p,克隆至真核报告载体pCAT3_Basic中,构建pCAT3_TXNRD1p报告载体;以该质粒转染肝癌细胞系HepG2,用酶联免疫吸附法(ELISA)检测氯霉素乙酰转移酶(CAT)的表达活性;并与pcDNA3.1(-)_NS5A共转染HepG2细胞系,用ELISA法检测CAT的表达活性。结果pCAT3_TXNRD1p和pcDNA3.1(-)_NS5A瞬时转染的HepG2细胞的CAT表达活性是pCAT3_Basic空载体的9.6倍,pCAT3_TXNRD1p的2.1倍。本实验进一步验证了我室利用SSH技术及基因表达谱技术发现的HCVNS5A蛋白反式激活TXNRDl基因转录作用的结果。结论我室克隆的TXNRD1启动子有顺式激活下游基因的活性;HCV的NS5A蛋白具有对TXNRD1基因启动子的反式激活作用。

日本凋毛藻(Griffithsiajaponica)硫氧还蛋白基因及其编码的蛋白特征

从日本凋毛藻的表达序列标记 EST库中筛选到 2 条全长的编码硫氧还蛋白的 cDNA序列,分别命名为GjTRX1和GjTRX2。将这2条基因编码的蛋白序列与其它藻类(包括酵母)进行比较,结果表明不同物种及同一物种间TRX的相似性都较差,除GjTRX2编码的蛋白序列外,所有蛋白在活性位点序列 WCGPC处都完全保守。推测GjTRX1属于细胞质内分布的硫氧还蛋白。GjTRX1序列推导的蛋白二级结构单元与以往报道的传统上保守的TRX的二级结构单元类型一致,但是顺序有所不同。

葡萄硫氧还蛋白基因（VvTrx）的克隆、表达和原核表达

硫氧还蛋白（thioredoxin，Trx）是一类高度保守的低分子量蛋白，广泛存在于植物、动物、细菌、酵母中，具有维持生物体内氧化还原平衡和调控生物信号传导等多种功能。该研究克隆了葡萄（Vit／svin@ra）VvTrx基因989bp的gDNA序列（GenBank登录号：EU280166）和561bp的cDNA序列（GenBank登录号：EU280164），

花生硫氧还蛋白AhTRX h基因的克隆及表达分析

h型硫氧还蛋白(TRX h)是最多的一类硫氧还蛋白,在种子萌发、氧化还原、信号传递以及响应生物和非生物胁迫等多种途径中起重要作用。以花生铝敏感品种‘中花2号’和耐铝品种‘99-1507’为材料,对h型硫氧还蛋白亚族成员AhTRX h进行克隆和表达分析。结果表明:该基因包含长为429 bp的完整开放阅读框,编码142个氨基酸;进化树分析表明,花生TRX h与鹰嘴豆TRX h、拟南芥TH9亲缘关系较近,且含有保守活性位点WCGPC;亚细胞定位显示,AhTRX h定位于叶绿体;构建原核表达重组质粒pGEX-6p-1-AhTRX h,转化大肠杆菌Rosetta菌种,在上清和沉淀均有表达,纯化获得可溶的具活性的重组蛋白,体外检测重组蛋白没有明显的发生亚硝基化的趋势。酵母双杂显示,AhTRX h蛋白没有自激活性,筛选花生文库获得互作蛋白——钙网蛋白和金属硫蛋白。该结果表明AhTRX h可能通过与钙网蛋白和金属硫蛋白相互作用,参与花生对铝胁迫响应。

烟草硫氧还蛋白基因NtTRX-hl的克隆和功能分析

从烟草中克隆了硫氧还蛋白基因NtTRX-hl并推导出其氨基酸序列,系统进化关系分析表明,NtTRX-hl与小麦、大麦、拟南芥等多种植物的TRX蛋白有很高的同源性.构建高效表达载体,诱导表达重组菌得到分子大小为22.26 kD的融合蛋白,与推测的分子量一致.用胰岛素和二硫苏糖醇作底物进行酶活性测定表明,Nt-TRX-hl具有活性.采用生物信息学的方法和工具分析了NtTRX-hl蛋白的生化参数和亚细胞定位,预测了该蛋白的高级结构.

转外源Trxs基因大麦耐盐性有关生理生化特性分析

以过量表达硫氧还蛋白s基因(Trxs)的转基因大麦株系(LSY-11-1-1)及其非转基因对照(CK)为试验材料,研究了50mmol/L盐胁迫条件下,Trxs过量表达对大麦幼苗耐盐性有关生理生化特性的影响。结果显示:盐胁迫下转基因大麦的鲜重与干重高于对照,而丙二醛(MDA)与羰基含量低于对照。盐胁迫下转基因大麦幼苗叶片的过氧化物歧化酶(SOD)活性与过氧化氢酶(CAT)活性普遍高于对照。转基因大麦类囊体中铁蛋白大量积累的持续时间比对照长。由此可以推测,Trxs至少可以通过两条途径缓解盐胁迫对大麦幼苗生长的抑制作用:一方面增强抗氧化酶活性、有效清除过量产生的活性氧;另一方面能促进铁蛋白含量的增加、抑制Fenton反应来减少活性氧的过量产生,从而赋予转基因大麦幼苗更强的抗盐胁迫能力。

反义trxs基因的导入对小麦种子发芽的影响

用基因枪将反义trxs基因导入小麦幼胚 ,经组织培养获得了抗性再生植株。PCR及限制酶切检测显示 ,反义trxs基因在转基因植株中基本完整。生化指标测定及发芽特性试验表明 ,与对照相比 ,转基因籽粒中Trxh活性明显降低 ;水溶蛋白和醇溶蛋白中巯基含量比率以及α 淀粉酶活性都有所下降 ;转基因种子的发芽势明显降低 ,但种子最终发芽率变化不大。