猪硫辛酸合成酶基因的克隆及组织表达

本试验通过电子延伸及RT-PCR技术克隆猪硫辛酸合成酶(lipoic acid synthase,Lias)基因,并进一步研究了该基因在猪体内组织的表达分布。基于电子延伸序列设计1对引物,成功克隆了猪Lias基因(GenBank登录号:JN797612.1),并进行了序列分析,同时利用RT-PCR方法分析了Lias基因的组织表达规律。克隆的猪Lias基因长度为1119 bp,包括1个完整的开放阅读框,编码372个氨基酸;克隆的猪Lias基因与小鼠、褐鼠、人、牛的核苷酸序列同源性分别为71.5%、69.0%、77.3%、70.4%;推导的cDNA编码区(CDS)的氨基酸序列与小鼠、褐鼠、人、牛的同源性分别为91.5%、79.4%、89.4%、88.2%;构建的系统进化树结果显示,猪与小鼠、褐鼠的亲缘关系最近;组织表达分布结果表明,Lias基因在心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、十二指肠、空肠、直肠、回肠、脂肪、皮肤和肌肉中都有表达;Gel-Pro软件分析结果表明,Lias基因在肾脏和脂肪组织中表达丰度最高,其次是直肠和回肠。

硫辛酸合成酶低表达对小鼠抗氧化能力的影响

目的建立一种硫辛酸合成酶基因低表达的基因修饰小鼠,并检测其抗氧化能力。方法将硫辛酸合成酶基因3􀆳-UTR区域Loxp小鼠与E2a-Cre小鼠杂交,从子代小鼠中鉴定出Lias^(L/+)小鼠并进一步繁殖、鉴定基因型。选取基因型为Lias^(L/L)和Lias^(+/+)的8周龄雄性小鼠各10只;称重、麻醉后经股动脉采血,然后分离小鼠肺、肾及肝,并称重。应用Western Blot、免疫组化方法检测肺、肾、肝组织中硫辛酸合成酶(LIAS)蛋白的表达水平;分离血清,检测总抗氧化能力(TAC);对肾、肝、肺匀浆后提取总蛋白,检测其SOD、CAT酶活性及MDA含量。结果Western Blot及免疫组化分析显示,除小鼠肝LIAS免疫组化分析结果外,Lias^(L/L)组小鼠较Lias^(+/+)组小鼠肾、肝及肺组织中LIAS蛋白表达水平均显著降低(P<0.05)。与Lias^(+/+)组小鼠相比,Lias^(L/L)组小鼠血清TAC水平显著降低(P<0.05),Lias^(L/L)小鼠肾、肝、肺脏器中SOD、CAT酶活性显著降低,MDA水平显著升高(P<0.05)。结论本研究鉴定了硫辛酸合成酶基因低表达的基因修饰小鼠,其在肾、肝及肺中表达较野生型小鼠均降低,并导致相应脏器的氧化损伤。

敲低WDHD1对鼻咽癌细胞增殖、铜含量及铜死亡相关因子的影响

目的探讨敲低WD重复序列和HMG框DNA结合蛋白1(WDHD1)对鼻咽癌细胞增殖、铜含量及铜死亡相关因子的影响。方法将鼻咽癌细胞(HK-1细胞和HONE-1细胞)分别分为对照组、敲低空载组(sh-NC组)、WDHD1敲低组(sh-WDHD1组)。对照组不做处理,sh-NC组、sh-WDHD1组分别转染阴性对照慢病毒、sh-WDHD1 RNA慢病毒。转染成功后,检测各组HK-1细胞和HONE-1细胞增殖活性、铜含量、铜死亡相关基因m RNA及蛋白表达情况;将sh-WDHD1组的HK-1细胞和HONE-1细胞分为sh-WDHD1对照组、sh-WDHD1/DMSO组、sh-WDHD1/ATTM组,分别使用完全培养基、含DMSO的完全培养基、含铜螯合剂ATTM的完全培养基进行培养,然后检测细胞铜含量。结果(1)与对照组和sh-NC组相比,sh-WDHD1组HONE-1细胞在24 h、48 h的增殖活力下降,HK-1细胞在48 h的增殖活力下降(P<0.05)。(2)在HONE-1细胞和HK-1细胞中,与对照组及sh-NC组相比,sh-WDHD1组的细胞铜含量增加,金属调节转录因子1(MTF1)的mRNA表达水平、硫辛酸合成酶(LIAS)的mRNA和蛋白表达水平增高,而血管内皮生长因子受体A(VEGFA)的mRNA表达水平、肿瘤蛋白p53(TP53)的mRNA和蛋白表达水平降低(P<0.05)。(3)与sh-WDHD1对照组及sh-WDHD1/DMSO组相比,sh-WDHD1/ATTM组HONE-1细胞和HK-1细胞的铜含量下降,HONE-1细胞在48 h的增殖活力增强,HK-1细胞在24 h、48 h的增殖活力增强(P<0.05)。结论敲低WDHD1可降低鼻咽癌细胞的增殖活性,增加细胞内铜含量蓄积,上调铜死亡促进因子LIAS、MTF1的表达,下调铜转运关键因子VEGFA及铜代谢关键因子TP53的表达。TP53和LIAS可能在WDHD1影响鼻咽癌细胞的铜蓄积和铜死亡进程中发挥重要作用。

猪LIAS基因微环表达载体的构建

为了构建猪LIAS基因长期高效的表达载体,本研究通过RT-PCR方法从猪肌肉组织中克隆了LIAS基因片段,并将该基因片段与微环表达载体minicircle进行连接,构建成微环载体minicircle-LIAS,然后转染HeLa细胞,检测其在HeLa细胞中绿色荧光蛋白的持续表达时间。结果表明,本研究克隆了猪LIAS基因,该基因长度为1 119bp,并将该基因成功构建到了微环表达载体minicircle上;转染HeLa细胞对绿色荧光蛋白持续表达时间的观察显示,构建的微环表达载体minicircle-LIAS中绿色荧光蛋白的持续表达时间明显高于常用的pEGFP-N1质粒,为进一步阐明LIAS合成的生化过程及功能调控提供了新思路和试验材料。

野油菜黄单胞菌中LipB-LipA是唯一的硫辛酰化途径

【目的】硫辛酸是细胞内重要的辅因子,参与多种基础代谢过程。野油菜黄单胞菌(Xcc)是十字花科植物黑腐病的病原菌,在全球范围内引起植物病害,引起重大经济损失。为此研究Xcc中硫辛酸的合成途径,为防治黑腐病提供新思路。【方法】利用大肠杆菌硫辛酸合成关键酶LipA和LipB序列,同源比对发现Xcc基因组中XC0713(XccLipA)和XC0712(XccLipB)具有较高的同源性。采用PCR方法分别扩增XccLipA和XccLipB基因,并连入表达载体pBAD24M后分别互补大肠杆菌突变株,并检测转化子生长表型。利用同源重组方法,获得替换突变株,分析其生长性状,并利用剪叶法检测替换突变株对寄主植物甘蓝的致病力。【结果】XcclipA和XcclipB能分别恢复大肠杆菌lipA和lipB突变株在基础培养上生长。XcclipA和XcclipB都是菌体生长的必需基因,不能直接被敲除。但导入pSRK-EclplA后,成功分别获得XcclipA和XcclipB敲除突变株。两种EclplA替换后的敲除突变株在基础培养上都不能生长,添加硫辛酸后能恢复生长表型。在丰富培养基上,XcclipB敲除突变株能正常生长,而XcclipA敲除突变株不能生长,添加硫辛酸后生长也能恢复。分别测定不同培养条件下生长曲线,也得到同样的结果。寄主植物侵染结果显示,与野生菌相比,XcclipA敲除突变株致病性几乎丧失,而XcclipB敲除突变株的致病性与野生菌无显著性差异。【结论】Xcc中lipA编码硫辛酸合成酶,lipB编码辛酰转移酶,两者都是必需基因。Xcc中LipB-LipA途径是唯一的硫辛酰化途径,而没有外源性的硫辛酸途径。lipA敲除后显著影响Xcc的致病性,可作为抗菌药物筛选的靶点。

矽肺患者PBMCs中LIAS和NRF2的表达及其与矽肺的相关性

目的探讨矽肺患者外周血单个核细胞(PBMCs)中硫辛酸合成酶基因(LIAS)及核因子E2相关因子2基因(NRF2)的表达及其与矽肺的相关性。方法于2019年5月,采用随机数字表法从正常健康体检人群中选取45人作为对照组,从矽肺患者中选取107人作为病例组。调查研究对象的基本资料并进行体格检查,采集外周血进行血细胞常规检测;采用免疫荧光法检测核因子E2相关因子2(NRF2)蛋白表达,实时荧光定量PCR测定LIAS、NRF2 mRNA表达水平。采用限制性三次样条(RCS)结合logistic回归分析PBMCs中LIAS、NRF2 mRNA表达水平的剂量-效应关系及其与矽肺的关联。结果与对照组比较,病例组单核细胞数明显增高,第一秒用力呼气量(FEV1.0)降低,差异均有统计学意义(P<0.05);壹期组矽肺患者PBMCs中NRF2阳性表达率明显高于对照组,贰期、叁期组矽肺患者NRF2阳性表达率均低于对照组及壹期组矽肺患者,差异均有统计学意义(P<0.01)。RCS结果显示,LIAS与NRF2 mRNA表达水平呈线性剂量-效应关系(总体关联性检验χ^(2)=223.230,P<0.01;非线性检验χ^(2)=1.340,P=0.511)。相关性分析显示,LIAS与NRF2 mRNA表达呈正相关(r=0.651,P<0.01)。多因素分析结果显示,调整潜在混杂因素(年龄、受教育程度、体质指数和吸烟)后,LIAS、NRF2与壹期矽肺发病风险的升高有关(OR=11.184、4.332,P<0.05);在矽肺贰期、叁期患者中NRF2显示为矽肺发病的保护因素(OR=0.225、0.208,P<0.05)。结论矽肺患者PBMCs中LIAS、NRF2 mRNA表达存在线性剂量-效应关系,并与矽肺发病相关。