生物素化ATP硫酸化酶的表达、固定化与应用

现代大规模焦测序技术的产生是DNA测序技术的一次革命,其关键技术之一是得到高活性的、固定于磁性微球表面的ATP硫酸化酶.生物素化的ATP硫酸化酶可以通过生物素与亲和素之间的特异结合特性固定在包被亲和素的磁性微球表面,但是利用化学修饰法将ATP硫酸化酶进行生物素化修饰很可能会影响酶的活性.利用融合表达策略,将大肠杆菌生物素酰基载体蛋白C端87个氨基酸肽段(BCCP87)与ATP硫酸化酶在大肠杆菌内融合表达,经SDS-PAGE和Westernblot分析,表达的融合蛋白分子质量约为64ku,并且能够在大肠杆菌内被生物素化.生物素化的ATP硫酸化酶能够与亲和素包被的磁珠结合,固定后的ATP硫酸化酶具有活性,并且能够用于定量检测焦磷酸盐(PPi)和焦测序,为今后建立高通量大规模焦测序系统提供了一个有效的工具酶.

嗜酸氧化亚铁硫杆菌ATP硫酸化酶的表达、纯化及性质鉴定

ATP硫酸化酶是一种催化ATP和SO42-反应生成腺嘌呤-5'-磷酸硫酸(APS)和焦磷酸盐(PPi)的酶,它是硫酸根同化反应第一步的关键酶。以嗜酸氧化亚铁硫杆菌(A.ferrooxidansATCC 23270)基因组为模板,用PCR扩增得到ATPS基因,并克隆到表达载体pLM1上。加入IPTG的诱导表达,用AKTA蛋白纯化仪的镍柱亲和层析纯化得到浓度和纯度都较高的ATPS蛋白。SDS-PAGE分析,证实其分子量大小为33 kD,并成功的测出了其活性,比活达3.0×103U/mg。

酿酒酵母ATP-硫酸化酶在大肠杆菌中的表达纯化及其在焦测序中的应用

ATP-硫酸化酶(ATPS,EC2.7.7.4)是一种可逆催化ATP和SO42-反应生成腺嘌呤-5′-磷酸硫酸(APS)和焦磷酸盐(PPi)的酶,已经用于焦测序反应。以酿酒酵母(Saccharomyces cerevisias,CICC1202)基因组DNA为模板,用PCR扩增得到ATPS基因,并克隆到原核表达质粒pET28a(+),得到重组表达质粒pET28a(+)-ATPS,在IPTG诱导下,携带pET28a(+)-ATPS的大肠杆菌BL21(DE3)表达分子量约为60kD的带有His标签的ATPS酶,经镍亲和层析和超滤两步纯化后,可得到电泳纯级ATPS,比活达5.1×104u/mg,并成功应用于焦测序反应中。

结核分枝杆菌硫酸化酶基因的克隆及其原核表达、鉴定及纯化

本文拟对结核分枝杆菌ATP硫酸化酶基因进行原核表达,并鉴定其抗原性。根据结核分枝杆菌H37Rv ATP硫酸化酶(cys D)基因设计引物,扩增出大小约为999bp的目的基因片段。将PCR纯化产物克隆至PMD18-T中,构建重组质粒载体PMD18-T-cys D。以SacⅠ和HindⅢ双酶切重组载体PMD18-T-cys D和表达载体p ET-32a(+),并将纯化的cys D基因亚克隆至p ET-32a(+)中,构建出原核重组表达质粒p ET-32a-cys D。将p ET-32a-cys D重组质粒转化至感受态细胞E.coli BL21(DE3)中,经IPTG诱导和SDS-PAGE分析,可见约55KD目的蛋白带。用Western blot分析方法鉴定该蛋白。结果显示纯化后所获得的融合蛋白与抗结核分支杆菌阳性血清发生特异性反应。表明研究成功构建了p ET-32a-cys原核表达载体,纯化的融合蛋白具有良好的免疫原性。

玉米钼辅助因子硫酸化酶基因启动子的克隆与功能验证

为克服组成型启动子启动外源基因过量表达引起的诸多问题,同源克隆(Mo-molybdopterin cofactor sulfurase)基因(ABA3)的启动子(ABA3s)序列,并用PlantCARE软件分析其非生物逆境应答元件,实时定量PCR检测ABA3基因在非生物逆境诱导下的差异表达后。然后,用该启动子构建启动GUS(β-glucuronidase)基因的表达载体,基因枪法转化玉米愈伤组织。经组织化学染色法检测其表达后,在高渗、高盐、低温胁迫处理及ABA诱导下检测GUS酶荧光值与荧光素酶(内参)发光值的比值(GUS/LUC),以此评价ABA3s启动子在非生物逆境胁迫下的启动活性。结果表明,ABA3基因在模拟干旱、低温、高温、高盐胁迫及ABA、乙稀诱导下差异表达,说明该基因的启动子(ABA3s)具有非生物逆境诱导活性。序列分析表明,ABA3s启动子全长777 bp,含有ARE、HSE、MBS、TGA、Circadian等多种非生物逆境胁迫应答元件。用ABA3s启动GUS基因构建的表达载体转化的玉米愈伤组织,响应干旱、低温、高温、高盐胁迫等多种非生物逆境胁迫,及ABA和乙稀诱导,GUS检测呈阳性。在8%甘露醇高渗条件下,GUS/LUC比值比空白对照高6倍。上述结果表明,ABA3s启动子具有非生物逆境诱导特性,经进一步验证其功能后,可用于玉米抗逆转基因研究。

卡拉胶多糖的分子修饰:卡拉胶酶和硫酸化酶的研究进展

卡拉胶(carrageenan)是一种从海洋红藻细胞壁中提取出来的多糖物质,通过1,3-β-D-吡喃半乳糖和1,4-α-D-吡喃半乳糖交替连接作为基本骨架形成的线性硫酸多糖。研究表明,卡拉胶及其分子修饰后获得的衍生物具有抗肿瘤、抗病毒、抗凝血、增强人体细胞免疫和体液免疫力等多方面生物活性。卡拉胶酶属于糖苷水解酶,通过使β-1,4糖苷键断裂来降解卡拉胶。卡拉胶硫酸酯酶又被称作卡拉胶硫酸化酶,是一种作用于卡拉胶寡糖的硫酸基使之游离出无机硫酸的酶。经研究证实,这两种酶对于卡拉胶多糖的降解具有协同作用。然而由于卡拉胶多糖结构的复杂性,人们对于卡拉胶的降解及分子修饰大多数尚未探索。现如今,随着技术的进步以及卡拉胶多糖生物活性的多样性,卡拉胶多糖的分子修饰引起了相关研究者的持续关注。作者概括了近年来卡拉胶多糖的分子修饰,重点介绍了卡拉胶酶和硫酸化酶的研究进展,进一步阐述了其修饰后的生理活性变化。

ATP硫酸化酶基因MoMET3在稻瘟病菌生长发育和致病过程中的功能分析

【目的】真菌对硫元素的利用始于ATP硫酸化酶对硫酸根离子的活化。对稻瘟病菌ATP硫酸化酶在病菌生长发育和致病过程中的功能进行分析,可为稻瘟病的防治提供药物靶标。【方法】采用同源重组方法构建基因敲除载体,并对突变体的表型进行分析。【结果】Mo MET3基因是病菌营养生长和分生孢子形成所必需的,但不是毒力因子。稻瘟病菌ATP硫酸化酶编码基因Mo MET3缺失后,突变体营养生长速率减慢,产孢量降低,但是突变体对寄主的毒力不受影响;虽然基因缺失不影响突变体分生孢子萌发和附着胞成熟,但突变体在硫营养限制时孢子萌发后次生菌丝的生长明显受抑。Mo MET3基因互补后,突变体恢复正常生长,能利用硫酸盐。【结论】无机硫的还原对分生孢子的萌发和附着胞的成熟并不是必需的,分生孢子内储存的还原态硫化合物可以满足这一过程中硫营养的需求,但病菌侵入寄主组织后需要吸收利用寄主源还原态硫以利于侵染菌丝的扩展。

油菜ATP硫酸化酶部分cDNA克隆及序列分析

ATP硫酸化酶(ATP sulfurylase,ATPS,EC 2.7.7.4)广泛存在于动物、植物、微生物中,可催化ATP和SO42-生成APS和PPi,也可以催化此过程的逆反应。用Genbank公布的的油菜ATPS全长序列与甘蓝、拟南芥以及洋葱的序列进行比对,得到一段保守性比较强的序列。采用RT-PCR方法从油菜‘秦优8号’的叶片获得880 bp长的cDNA片段,命名为RATPS_8。序列分析和比对结果表明:RATPS_8与已报道的甘蓝、芥菜和油菜的基因同源性分别为95%、92%和91%,进化树聚类分析和预测氨基酸的BLAST结果证实,RATPS_8为油菜‘秦优8号’ATP硫酸化酶的部分基因片段。

辣椒ATP硫酸化酶基因(CaATPS1)的克隆与逆境表达

采用RT-PCR和RACE方法,克隆了叶绿体ATP硫酸化酶基因的全长序列,命名为Ca ATPS1,Gen Bank登录号为KX009745。该基因包含1个长为1 377 bp的完整开放阅读框,编码458个氨基酸,预测分子量51.11 k D,等电点6.74。氨基酸同源性分析表明,该基因与Gen Bank中登录的茄科植物烟草、马铃薯及其它物种中的ATPS1氨基酸序列具有较高的同源性;进化树分析表明,辣椒Ca ATPS1与同为茄科属的烟草、马铃薯和胡麻属的芝麻处于同一进化分枝上,而与十字花科植物进化关系较远;荧光定量PCR分析显示,Ca ATPS1能被低温、干旱、高盐、机械损伤、过氧化氢、水杨酸、乙烯利以及DC3000侵染等各种胁迫和信号分子诱导。

多酶一锅法合成硫酸基供体3′-磷酸腺苷-5′-磷酸硫酸(PAPS)

以腺嘌呤核苷三磷酸(ATP)等为原料,来源于乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)的ATP硫酸化酶(ATPS)和来源于产黄青霉菌(Penicillium chrysogenum)的APS激酶(APSK)构建的多酶催化体系可合成3′-磷酸腺苷-5′-磷酸硫酸(PAPS)。同时,在酶法合成PAPS的反应体系中引入铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)来源的无机焦磷酸水解酶(PPase),消耗反应过程中的副产物PPi,使得反应向生成PAPS的方向进行,大幅提高多酶法合成PAPS的产率。本研究构建了重组质粒pET-28a-sumo-ATPS、pET-28a-APSK和pET-28a-PPase,并在大肠杆菌中表达了重组酶,研究酶学性质和优化多酶催化反应合成PAPS的反应条件,以提高PAPS的产量水平,最终PAPS的累积量为14.47 g/L。该工艺可大幅降低PAPS的制备成本。

植物硒代谢积累及相关酶的研究进展

阐述了植物硒代谢的基本途径及其积累的分子机制,详细介绍了几种参与硒代谢的关键性酶的分子生物学特性。并展望了有关植物硒代谢的发展趋势。

氮硫供应对大葱含硫有机物及其代谢关键酶活性的影响

以长白型大葱品种章丘大葱和鸡腿型大葱品种隆尧鸡腿葱为试材,采用基质盆栽试验研究了不同氮、硫供应水平对大葱含硫有机物含量及其代谢关键酶活性的影响。结果表明,隆尧鸡腿葱含硫有机物含量显著高于章丘大葱。氮、硫供应显著影响植株地上部氮、硫含量与代谢关键酶活性。氮素供应水平为1.5mmol/L时抑制大葱地上部ATP硫酸化酶(ATPS)和O-乙酰丝氨酸水解酶(OASS)活性,而氮素供应水平为12.0 mmol/L时明显促进上述两种酶的活性,但氮素供应水平上升到24.0 mmol/L时则抑制了其活性。提高供硫水平则显著抑制ATPS酶和OASS酶的活性。植株含氮量与有机硫含量均与ATPS和OASS活性显著相关。

拟南芥miR395d基因的克隆和过表达载体构建及其在油菜中的转化

MicroRNAs(miRNAs)是一类内源性长度约为21～24个核苷酸,在基因表达、生长发育、细胞周期及环境胁迫等方面起着重要作用的单链非编码小分子RNA。研究表明:植物miRNAs通过转录后以切割的方式对其靶基因的表达起着负调控作用。miR395的靶基因分别为ATP硫酸化酶和硫转运体SULTR2;1,两者在硫同化及转运中起着重要的作用。为了进一步探究miR395的功能,本研究利用PCR法从拟南芥中克隆了miR395d前体基因,并与pCAMBIA1304载体连接,构建了miR395d前体基因的过量表达载体,通过根癌农杆菌介导法将其转化到甘蓝型油菜特选4号中,目前已获得了转基因植株。

硫酸化相关酶在青少年特发性脊柱侧凸关节突软骨中的表达研究

[目的]分析硫酸化相关酶在AIS患者关节突软骨中的表达特点,为软骨细胞的力学研究和延缓脊柱侧凸进展提供参考。[方法]选取18例Lenke 1型AIS患者顶椎和下端椎凹、凸侧和对照组(15例)的下关节突软骨作为研究对象,固定脱钙后制成石蜡切片。免疫组化染色测定分析硫酸化反应相关酶PAPSS2、PAPST1和CHST1在Lenke 1型AIS患者顶椎和下端椎关节突软骨中的表达,利用Leica显微镜对免疫组化图像进行观察,用Image-pro Plus软件将每个视野中的着色面积、光密度以及目标数目转换成累积光密度值(IOD),代表相应酶的表达强度,最后进行统计学分析。[结果]PAPSS2主要分布在软骨细胞质和软骨囊基质;PAPST1特异性分布在软骨细胞质;CHST15主要分布在软骨细胞质和软骨囊基质。硫酸化反应相关酶PAPSS2、PAPST1和CHST15的表达转换成IOD有以下分布特点:对照组两侧的表达差异无统计学意义;顶椎凹侧高于凸侧,顶椎凸侧高于对照组,差异有统计学意义;顶椎高于同侧下端椎,差异有统计学意义;下端椎的凹凸侧的表达差异无统计学意义;下端椎的表达与对照组的表达比较差异无统计学意义。[结论]青少年特发性脊柱侧凸顶椎关节突硫酸化反应相关酶的表达增强与特发性脊柱侧凸进展相关。

前列腺癌组织中酪氨酸硫酸化转移酶1(TPST1)的表达水平及临床意义

目的分析酪氨酸硫酸化转移酶1(TPST1)在前列腺癌(PCa)组织中的表达情况,并探讨其与前列腺癌患者临床病理特征和预后的关系。方法在肿瘤基因组图谱(TCGA)数据库收集499例前列腺癌患者,分析TPST1 mRNA与PCa患者临床病理特征及预后的关系;采用免疫组织化学SP法检测前列腺组织芯片(TMA)中TPST1蛋白的表达,并分析其与PCa患者临床病理特征的关系。结果 TCGA数据库结果显示TPST1表达量与年龄具有显著相关性(P<0.05),与血清PSA、Gleason评分、临床T分期、淋巴结转移和远处转移相关性没有统计学意义(P>0.05);免疫组化结果显示,PCa癌组织中TPST1蛋白的高表达率为78.0%(39/50),明显高于非前列腺癌组织的46.67%(14/30),差异有统计学意义(P<0.05);TPST1的TMA分析结果显示,TPST1蛋白表达量与年龄、肿瘤分级、Gleason评分、临床T分期、淋巴结转移以及远处转移相关性没有统计学意义(P>0.05);TCGA数据库样本的Kaplan-Meier生存分析结果显示TPST1 mRNA高表达组的无生化复发生存情况和无病生存情况差于低表达组,差异有统计学意义(P<0.05);COX单因素和多因素分析结果显示,TPST1不是影响PCa患者生存预后的独立危险因素。结论 TPST1在PCa癌组织中呈高表达,TPST1高表达提示预后差,但其与PCa患者临床分期、淋巴结转移无明显相关性,不是影响PCa患者生存预后的独立危险因素。

玉米ST和ATPS部分cDNA序列克隆及分析

硫酸盐转运蛋白(ST)和ATP硫酸化酶(ATPS)是根系吸收硫酸盐和植物体内硫酸盐同化过程的关键蛋白和酶,在硫酸盐的生物转运过程中具有重要作用.以水培玉米农大108根系为材料,并根据已报道的玉米的硫酸盐转运蛋白和ATP硫酸化酶基因保守序列分别设计PCR引物对,采用RT-PCR方法克隆到783 bp和820 bp的部分硫酸盐转运蛋白和ATP硫酸化酶cDNA片段,分别命名为ST_ND108和ATPS_ND108.序列分析和比对结果显示,ST_ND108与已报道的玉米和水稻的高亲和型硫酸盐转运蛋白基因同源性分别为99%和85%;而ATPS_ND108与已报道的玉米ATP硫酸化酶基因同源性达到97%,进化树聚类分析和预测氨基酸的BLAST结果证实ST_ND108为高亲和性硫酸盐转运蛋白基因片段,ATPS_ND108为质体ATP硫酸化酶基因片段.

硫酸盐活化复合体的分类及其功能

硫酸盐进入细胞内活化的第一步是ATP硫酸化酶(ATP sulfurylase,ATPS)催化硫酸盐与ATP反应生成腺苷-5’-磷酰硫酸(adenosine 5’-phosphosulfate,APS)和焦磷酸,此反应非常不易进行。研究发现某些ATPS可与硫酸盐同化代谢相关酶组成硫酸盐活化复合体(sulfate activating complex,SAC)而促进硫的同化。本文介绍了目前已发现的三类SAC:GTPase型SAC(GTPase type SAC)、APSK型SAC(APSK type SAC)和APSR型SAC(APSR type SAC),并对其促进APS合成的方式及目前的研究热点进行了讨论。

甲状腺乳头状癌组织酪氨酸硫酸化转移酶1、核受体共激活因子5蛋白表达与预后的关系

目的研究甲状腺乳头状癌(PTC)组织酪氨酸硫酸化转移酶1(TPST1)、核受体共激活因子5(NCOA5)蛋白表达与预后的关系。方法选取2015年3月至2018年3月在本院行手术治疗的102例PTC患者,分别采集患者癌组织和癌旁正常组织,检测并比较不同组织中TPST1和NCOA5蛋白表达情况,分析其与PTC患者临床病理特征和预后的关系,同时分析PTC患者预后的影响因素。结果TPST1蛋白阳性表达定位于细胞质内,NCOA5蛋白阳性表达定位于细胞核。癌组织中TPST1蛋白阳性表达率明显低于癌旁正常组织,而NCOA5蛋白阳性表达率则明显高于癌旁正常组织,差异均有统计学意义(均P<0.05)。TPST1和NCOA5蛋白阳性表达与肿瘤大小、肿瘤分期、包膜侵犯、淋巴结转移有关,差异均有统计学意义(均P<0.05)。102例患者中预后不良组67例,预后良好组35例。TPST1阳性表达患者预后不良人数占比明显低于TPST1阴性表达患者,而NCOA5阳性表达患者预后不良人数占比则明显高于NCOA5阴性表达患者,上述差异均有统计学意义(均P<0.05)。多因素Logistic全模回归分析显示:临床分期Ⅲ~Ⅳ期、TPST1阴性表达以及NCOA5阳性表达均为患者不良预后的危险因素(均P<0.05)。结论PTC组织中TPST1蛋白低表达而NCOA5蛋白高表达,其表达水平和PTC肿瘤大小、临床分期、包膜侵犯、淋巴结转移以及预后密切相关。

蛋白酪氨酸硫酸化修饰的研究进展

无机硫酸盐与生物分子的结合在生物体系中具有重要的作用,并且与疾病的发生直接相关。蛋白酪氨酸硫酸化(protein tyrosine sulfation,PTS)是一个普遍的翻译后修饰,从其第一次被报道至今已有50余年。然而,酪氨酸硫酸化在生理条件下的意义以及与疾病的关系在最近几年才逐渐受到关注。目前,只有极少量的硫酸化蛋白质得以鉴定。现选择性地对蛋白酪氨酸硫酸化做一个简要的回顾,并总结了基本的生物化学信息,包括酪氨酸蛋白硫酸转移酶的制备、蛋白酪氨酸硫酸化的测定方法、蛋白酪氨酸硫酸化的生物学功能。这些信息是将来对蛋白酪氨酸硫酸化功能进一步探索的基础。