硫酸软骨素裂解酶ABCⅡ的高效融合表达及其酶学性质研究

目的:本研究旨在实现硫酸软骨素裂解酶ABCⅡ(chondroitinase ABCⅡ,ChSase ABCⅡ)的高效可溶性表达并研究其酶学性质,为ChSase ABCⅡ在药品和保健食品生产中的应用奠定基础。方法:在优化ChSase ABCⅡ基因原始序列的基础上,构建重组质粒pET-28a-His-ChSase ABCⅡ并优化其表达条件;利用亲和层析得到带有多聚组氨酸标签(polyhistidine-tag,His-tag)的ChSase ABCⅡ融合蛋白后,研究了His-ChSase ABCⅡ的部分酶学性质。结果:构建的His-ChSase ABCⅡ融合蛋白表达系统能在大肠杆菌中实现可溶性表达;在表达宿主为E.coli BL21(DE3)和诱导剂(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)浓度为125μmol/L的优化条件下,发酵液酶活力可达到7206.83±184.27 IU/L;纯化后的His-ChSase ABCⅡ酶比活力为22.02±0.39 IU/mg蛋白,最适pH和温度分别为7.5和40℃,其在30~40℃条件下较为稳定,且半衰期在2 h以上。His-ChSase ABCⅡ能特异性有效分解硫酸软骨素,其K_(m)值为10.4±0.8μmol/L,Kcat值为9.4±0.2 s^(-1)。结论:本论文通过基因优化和融合表达等策略实现了His-ChSase ABCⅡ的高效表达和纯化。此外,His-ChSase ABCⅡ的酶学性质可基本满足其在医药和营养产品工业生产中的应用需求。

硫酸软骨素裂解酶ABC产生菌的筛选及发酵工艺研究

从成都井研生猪屠宰厂等地采集的样品中平板分离粗筛到 4 8株硫酸软骨素裂解酶 ABC产生菌 ,进一步复筛出一株高产、稳定的硫酸软骨素裂解酶 ABC产生菌株 GT38,初步鉴定为彭氏变形菌 (P.pen-neri)。通过单因素实验和正交分析研究了摇瓶最适产酶条件和 2 L 实验室小罐发酵工艺 ,该菌的最适发酵工艺为培养基大豆蛋白胨 2 .5 % ,蔗糖 1.5 % ,Na Cl0 .4 % ,硅油 0 .0 5 % ,p H7.5 ,接种量 5 % ,通气量 1∶ 1～1∶ 1.2 (v/ v) ,搅拌转速为 6 0 0 r/ min,30℃发酵 10 h,酶活力单位高达 32 2 U/ L。

硫酸软骨素裂解酶ABC产生菌的筛选及酶学性质的初步研究

从成都市井研县生猪屠宰厂等地采集的样品中筛选出一株高产、稳定的硫酸软骨素裂解酶ABC产生菌株GT38,初步鉴定为彭氏变形杆菌(P.penneri).其酶活力单位高达112U/L.酶学性质经初步研究表明:该酶的最适反应pH值为7.0,最适反应温度为30℃,在pH值6～8之间较稳定,温度在30℃～45℃较稳定,金属离子对酶活力影响不大.

硫酸软骨素裂解酶ABC的制备

本文介绍了简便易行的制备硫酸软骨素裂解酶ＡＢＣ的方法。从普通变形杆菌６０１０菌体中提取了硫酸软骨素裂解酶ＡＢＣ，经链霉素沉淀，硫酸铵沉淀，ＤＥＡＥ—纤维素柱层析和磷酸纤维素柱层析五步后，酶比活力提高９１倍，纯品经聚丙烯酰胺凝胶电泳显示单一蛋白带。

同时测定软骨酶解物中硫酸软骨素及透明质酸含量的高效液相色谱法的建立

为了准确快速同时测定软骨酶解物中硫酸软骨素和透明质酸含量,以半乳糖胺和葡萄糖胺为测定目标物,通过优化色谱条件和方法性试验,建立了一种高效液相色谱的测定方法。使用ZORBAX C18柱分离,用乙腈和乙酸铵溶液为流动相进行梯度洗脱,流速为1.00 mL/min,在波长250 nm下测定。方法性试验表明,硫酸软骨素和透明质酸的质量浓度在100~500 mg/L范围与峰面积线性关系良好,其中硫酸软骨素的检出限为0.948 mg/L,重复性偏差0.089%,平均回收率99.71%,相对偏差0.35%;透明质酸的检出限为0.027 mg/L,重复性偏差0.045%,平均回收率97.74%,相对偏差0.92%。与传统方法相比,该法具有受杂质干扰影响小,准确度高,重复性优异,回收率以及精确度高的优势,可以实现准确快速同时测定软骨酶解物中硫酸软骨素和透明质酸的含量。

pH渐变条件下多酶分步连续酶解工艺制备鲟鱼硫酸软骨素与胶原蛋白肽

pH渐变条件下采用碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶和菠萝蛋白酶分步连续酶解鲟鱼软骨,同时制备鲟鱼硫酸软骨素和胶原蛋白肽。分别通过温度、酶解时间、酶用量3个单因素实验,研究其对连续酶解效果的影响。综合分析得出最佳条件:碱性蛋白酶酶解温度为45℃,酶解时间为2 h,酶用量为100 U·g^(-1)底物;木瓜蛋白酶的酶解温度为50℃,酶解时间为2 h,酶用量为50 U·g^(-1)底物;菠萝蛋白酶的酶解温度为50℃,酶解时间为2 h,酶用量为30 U·g^(-1)底物。该工艺条件下制备的鲟鱼硫酸软骨素提取率为85%,纯度93%,胶原蛋白肽的提取率为82%,纯度为90%。研究建立的pH渐变条件下多酶分步连续酶解工艺,产率与纯度较国内现有生产方法均有提高,且碱液使用量减少,避免了有机溶剂的引入,从而可以降低生产成本,减轻环境污染负担。

假节杆菌PL-410产软骨素裂解酶制备条件优化

为确定获得软骨素裂解酶产生菌的分类地位及提高菌株产酶水平,通过形态学和16S rRNA基因序列分析鉴定菌株PL-410,并采用单因素试验、Plackett-Burman试验、最陡爬坡试验和Box-Behnken响应面试验优化菌株PL-410的产酶条件。结果表明,菌株PL-410为假节杆菌属(Pseudarthrobacter sp.),命名为假节杆菌PL-410;优化的最佳培养基为牛软骨硫酸软骨素添加量7.5 g/L、胰蛋白胨添加量2.5 g/L、NaCl添加量5 g/L、KH2PO4添加量0.3 g/L、培养基初始pH 6.53,最佳发酵条件为接种量2.98%、摇瓶装液量8%、摇床转速160 r/min、发酵温度24℃、发酵时间27.63 h,在此条件下软骨素裂解酶的活力(2531.765 U/L)比优化前(85.229 U/L)提高28.7倍,可更有效地降解牛软骨硫酸软骨素。

微生物硫酸软骨素裂解酶的研究进展

目的综述硫酸软骨素裂解酶的种类、分离纯化方法及药理学作用的研究进展。方法在检索国内外相关文献的基础上 ,对硫酸软骨素裂解酶的种类、分离纯化方法及药理学作用进行整理和归纳。结果硫酸软骨素裂解酶具有 4种类型 ;硫酸软骨素裂解酶可作为工具酶及药用酶用于基础理论及药学领域的研究中。结论作为工具酶和药用酶 ,硫酸软骨素裂解酶在科研及医药领域拥有广阔的发展前景。

温和气单孢菌YH311硫酸软骨素裂解酶的分离纯化与固定化

通过硫酸铵沉淀、QAE SephadexA5 0柱层析及SephadexG 1 5 0凝胶过滤等纯化步骤 ,对源自温和气单孢菌YH31 1的ChSase进行了分离纯化。结果表明 ,ChSase经上述纯化步骤后被纯化了 5 5倍 ,其最终纯度可达 95 %以上 ,比活为 31 86u mg。经SDS PAGE及IFE测定可知该酶的分子量约为 80kD ,等电点为 4 3～ 4 8。将纯化后的ChSase用海藻酸钠或纤维素固定化后 ,ChSase的热稳定性及贮存稳定性均可得到大幅度的提高 :固定化酶用 80℃水浴处理 1 2 0min或于 4℃冰箱放置 30d后仍可保留 5 0 %以上的相对活力 ;但固定化酶的收率较低 ,仅为 1 8 5 6 %和1 8 86 %。

硫酸软骨素裂解酶发酵培养基的获得及发酵条件的优化

目的考察发酵培养基中碳源、氮源及无机盐等因素及各种发酵条件对温和气单孢菌YH311产硫酸软骨素裂解酶的影响,获得硫酸软骨素裂解酶最佳发酵培养基和发酵条件。方法采用单因素实验法、均匀设计法及正交设计法。结果获得的最优培养基配方(g·L-1)为:葡萄糖2 5 ,牛肉膏5 0 0 ,硫酸软骨素10 0 ,尿素0 5 ,MgSO4·7H2 O 9 0 ( pH 7 0 ) ;最适产酶条件为:2 % ( φ)种子液,2 8℃,2 0 0r·min-1,振荡通气培养2 4h。在优化条件下,硫酸软骨素裂解酶的产率可达110 0 0U·L-1。结论通过对发酵培养基及发酵条件的优化可将硫酸软骨素裂解酶的产量提高5倍。

鱼翅中硫酸软骨素的酶解-高效液相色谱法测定

建立了一种测定鱼翅中硫酸软骨素的酶解 -高效液相色谱方法 ;该法利用在一定条件下硫酸软骨素能被硫酸软骨素酶ABC定量酶解成软骨素二糖 。

硫酸软骨素酶ABC-聚乳酸-聚乙醇酸共聚物缓释微球的制备及其体外性质

背景:硫酸软骨素酶ABC能够分解脊髓损伤局部持续产生的硫酸软骨素蛋白多糖,从而促进轴突的生长,但该酶性质不稳定,需要多次局部用药。目的:制备硫酸软骨素酶ABC-聚乳酸-聚乙醇酸共聚物缓释微球,观察其体外释药特性。设计、时间及地点:重复测量设计,于2006-03/2007-01在中国科学院成都有机所和四川大学华西医学中心药理实验室完成。材料:聚乳酸-聚乙醇酸共聚物、硫酸软骨素酶ABC、CH2Cl2、硫酸软骨素B。方法:复乳法制备硫酸软骨素酶ABC缓释微球,并以生理盐水为体外释药介质。主要观察指标:扫描电镜下观察硫酸软骨素酶ABC缓释微球的形态。应用Malvern激光粒度分布测试仪测定其粒径分布并自动计算微球的平均粒径和径距。采用酶解分光光度测定硫酸软骨素酶ABC含量,并计算载药量与包封率。于0.5,1,1.5,2,3,4,6,8,10,12,14,16,18,21d取样,绘制体外释药曲线。结果:硫酸软骨素酶ABC缓释微球形态均匀,其平均粒径5.538μm,径距1.479,呈正态分布。平均载药量(15.55±0.90)×10-3%,平均包封率(53.88±1.45)%,硫酸软骨素酶ABC微球在3周内的体外累积释药分数为0.8514,释药平稳,其最佳体外释药拟合方程为Weibull方程:lnln(1/1-Y)=0.7396lnX-1.617,R2=0.9933。结论:所制备的硫酸软骨素酶ABC微球形态均匀,粒径分布窄,再分散性好,3周内能维持有效的药物浓度。

硫酸软骨素酶ABC对大鼠脊髓损伤后硫酸软骨素蛋白多糖与胶质纤维酸性蛋白表达的影响

目的探讨硫酸软骨素酶ABC对严重脊髓损伤(SCI)大鼠硫酸软骨素蛋白多糖(CSPGs)及胶质纤维酸性蛋白(GFAP)表达的影响。方法制作大鼠脊髓横断伤模型,60只大鼠随机分为对照组10只、损伤组25只和治疗组25只。治疗组给予硫酸软骨素酶ABC髓鞘浸润治疗。用免疫荧光组织化学观察脊髓CSPGs的表达;用免疫荧光组织化学及Western-blot方法观察脊髓GFAP的表达。结果 SCI后星形胶质细胞明显活化增殖,CSPGs和GFAP的表达明显增加(P<0.05);治疗组脊髓CSPGs和GFAP的表达均较损伤组减少,差别均有统计学意义(P<0.05)。结论硫酸软骨素酶ABC能够裂解CSPGs,改善SCI区的微环境,改善GFAP蛋白的表达,是修复SCI,促进神经再生的机制之一。

硫酸软骨素酶缓解视网膜变性大鼠光感受器细胞凋亡

为建立RP动物模型,经玻璃体腔注射ChABC酶,免疫荧光法观察CSPGs的表达,反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)法检测多功能蛋白聚糖(Versican)mRNA的表达,检测光感受器凋亡情况,以探讨硫酸软骨素酶ABC(ChABC)对碘酸钠诱导的视网膜变性大鼠光感受器细胞凋亡的影响。结果表明:正常组CSPGs于脉络膜、内核层、节细胞层弱阳性表达,造模4周后CSPGs扩增到外核、外丛状层,各层荧光明显增强,而同期ChABC酶治疗组CSPGs在各层表达明显减弱;Versican mRNA表达与此一致,正常对照组、变性对照组、PBS组、治疗组Versican mRNA灰度比分别为0.18±0.02、0.92±0.03、0.98±0.06和0.30±0.01,治疗组明显低于变性组,差异极显著(P<0.01);各组光感受器凋亡率分别为(7.33±1.03)%、(40.0±2.37)%、(41.83±2.32)%、(35.2+1.94)%,治疗组显著低于变性组,差异极显著(P<0.01)。证明ChABC酶能通过降解变性大鼠视网膜异常沉积的CSPGs,抑制光感受器细胞的凋亡,从而促进损伤网膜的修复。

硫酸软骨素酶ABC对大鼠脊髓损伤修复的影响

为了探讨硫酸软骨素酶ABC对脊髓损伤后损伤局部瘢痕形成和脊髓传导功能修复的影响,本研究首先制作大鼠脊髓全横断损伤动物模型,并将其分为脊髓损伤组(A组)和脊髓损伤治疗组(B组)。在观察期内对动物的行为学表现进行BBB评分;用免疫荧光组织化学方法观察损伤4周后硫酸软骨素酶ABC对损伤局部的硫酸软骨素蛋白聚糖(CSPGs)的裂解作用;用辣根过氧化物酶(HRP)示踪法观察损伤8周后神经纤维的再生情况。结果显示:A组与B组之间动物的行为学评分B组优于A组,有显著性差异(P<0.01);B组动物脊髓内硫酸软骨素蛋白聚糖阳性物质的表达明显低于A组,具有显著性差异(P<0.05),而硫酸软骨素核心蛋白的表达无显著性差异(P>0.05);HRP示踪法显示B组脊髓损伤头端可见少量HRP标记的神经元胞体和纤维。本研究结果提示硫酸软骨素酶ABC能够裂解CSPGs中的葡胺聚糖链,减少瘢痕,促进损伤的神经纤维再生。

硫酸软骨素酶ABC对大鼠急性脊髓损伤后神经中丝和胶质纤维酸性蛋白的影响

目的:探讨硫酸软骨素酶ABC(ChABC)对大鼠急性脊髓损伤后神经中丝200(NF200)和胶质纤维酸性蛋白(GFAP)的影响。方法:SD大鼠72只,雌雄不限,随机分为假手术组(A组)、损伤对照组(B组)和ChABC治疗组(C组),每组24只。A组仅打开椎板及置管,不损伤脊髓,不给药;C组和B组均采用Allen′s法制作大鼠T10脊髓损伤模型,分别在伤后即刻和随后每天1次连续1周蛛网膜下腔注射ChABC(6μl/次)和等量生理盐水。术后1d、1周、2周和4周每组各处死6只大鼠,B组和C组以损伤区为中心、A组在相应部位切取1cm长的脊髓组织,以HE染色观察脊髓组织形态变化,应用免疫组化方法检测脊髓组织中NF200和GFAP的变化。结果:HE染色示A组脊髓无胶质细胞增生和胶质瘢痕形成;B、C组脊髓损伤区有胶质细胞增生和胶质瘢痕,C组明显少于B组。A组术后1d、1周、2周和4周时NF200阳性细胞数及灰度值和GFAP染色阳性面积无差异,1、2、4周时B、C组脊髓损伤区NF200染色阳性细胞数及灰度值和GFAP染色阳性面积均较A组显著增加(P<0.05或P<0.01),1d和1周时C组NF200染色阳性细胞数及灰度值与B组比较无显著性差异,2周和4周时C组明显高于B组(P<0.05);1d、1周和4周时C组GFAP染色阳性面积与B组无显著性差异,2周时C组显著小于B组(P<0.05)。结论:ChABC能提高大鼠急性脊髓损伤后神经细胞内NF200的表达并抑制GFAP的表达,进而促进神经细胞的修复,抑制胶质细胞的增生和胶质瘢痕的形成,对脊髓损伤具有保护作用。

硫酸软骨素酶ABC对大鼠脊髓损伤后神经元修复的影响

目的探讨硫酸软骨素酶ABC(ChABC)对脊髓损伤后神经元修复的影响。方法SD大鼠72只,雌雄不限,随机分为假手术组、生理盐水对照组和ChABC治疗组,采用Allen法打击大鼠胸10脊髓损伤模型,分别在伤后即刻和随后每天1次连续1周蛛网膜下注射生理盐水和ChABC。在伤后第1天,第1、2、4周应用免疫组化检测各组组织切片中NF200的变化,尼氏染色观测各组脊髓切片中尼氏体和神经元的改变,BBB评分检测损伤的后肢运动恢复情况。结果大鼠脊髓损伤后1d和1周给药组NF200着色面积、Nissl染色阳性细胞和BBB评分与生理盐水组比较差异无统计学意义。在2、4周,治疗组要显著优于生理盐水组(P<0.05)。结论ChABC能促进大鼠脊髓损伤后神经元的修复,提高后肢运动功能的恢复。

硫酸软骨素酶ABC-PLGA缓释微球处理去细胞同种异体神经移植修复大鼠坐骨神经

目的探讨硫酸软骨素酶ABC(chondroitinase ABC,ChABC)-聚乳酸-聚乙醇酸共聚物缓释微球处理改良化学法去细胞同种异体神经移植修复大鼠坐骨神经的可行性。方法用复乳法制备硫酸软骨素酶ABC-聚乳酸-聚乙醇酸共聚物缓释微球。取成年雄性SD大鼠40只,随机分为4组(n=10):硫酸软骨素酶ABC-聚乳酸-聚乙醇酸共聚物缓释微球处理改良化学法去细胞同种异体神经移植组(A组)、自体神经移植组(B组)、改良化学法去细胞同种异体神经浸泡ChABC神经移植对照组(C组)、改良化学法去细胞同种异体神经移植09%氯化钠注射液对照组(D组)。取A、C、D 3组动物人工切取右侧坐骨神经10 mm,用改良化学法制备移植神经段:A、C两组浸泡在PBS液中,D组浸泡在含2 U/ml ChABC的PBS液(pH7.4)中。A组动物取C组制备神经行同种异体神经移植,外膜无张力缝合,并在移植神经段距近心端缝合处2 mm、4 mm、6 mm、8 mm处分别注入0.2μl制备好的硫酸软骨素酶ABC-PLGA缓释微球。B组在右侧离断10 mm坐骨神经倒置后行外膜缝合。C组取D组制备神经行神经移植。D组取A组制备神经行神经移植后,按照A组的位置注入等量等渗0.9%氯化钠注射液。术后4、8、12周进行大体标本观察,术后12周行电生理检测、HE染色、镀银染色及电镜组织学检测、图像分析对比。结果制备所得硫酸软骨素酶ABC微球表面光滑,球体大小各异且均匀,无粘连及成簇等现象,Weibull方程曲线显示硫酸软骨素酶ABC微球体外释药稳定。采用硫酸软骨素酶ABC-聚乳酸-聚乙醇酸共聚物缓释微球处理改良化学法去细胞同种异体神经移植能够促进大鼠神经缺损处的轴突再生,提高神经修复的速度和质量,再生神经直径较粗,粘连较轻,电生理检测和组织学观察显示各项指标均优于两对照组,且较两对照组修复效果更接近于自体神经移植。结论硫酸软骨素酶ABC-聚乳酸-聚乙醇酸共聚物缓释微球处理改良化学法去细胞同种异体神经移植可以修复大鼠神经损伤。

响应面法优化硫酸软骨素提取的酶解工艺

目的以猪喉软骨为原料,提取硫酸软骨素,优化酶解工艺条件。方法采用碱提-酶解-醇沉的方法提取硫酸软骨素,在单因素试验的基础上,通过响应面分析优化酶解工艺。结果酶解最佳工艺组合为:胰酶浓度1.0%、pH值8.6、酶解温度46℃、酶解时间2.8 h。结论采用上述组合,以氨基葡萄糖含量为指标,氨基葡萄糖含量达25.94%。研究结果具有工业应用价值。

骨髓间充质干细胞与硫酸软骨素酶ABC联合移植对大鼠脊髓损伤的修复作用及其机制

目的观察骨髓间充质干细胞(BMSCs)与硫酸软骨素酶ABC(ChABC)联合移植对大鼠脊髓损伤的修复作用,并探讨其机制。方法 80只脊髓亚急性损伤大鼠随机分为4组各20只。损伤后第6天,A组先后移植2.0×10~6/μL的原代BMSCs细胞悬液、1 U/mL的ChABC各20μL,B组予等量BMSCs,C组予等量ChABC,D组予等量PBS。比较各组运动功能评分(BBB评分)、脊髓损伤区面积及后肢体感诱发电位(SEP)、经颅磁刺激运动诱发电位(MEP)潜伏期和胶质纤维酸性蛋白(GFAP)、生长相关蛋白-43(GAP-43)、脑源性神经生长因子(BDNF)阳性细胞百分比。结果与D组比较,其余3组制模后第1天BBB评分降低,第14、28天BBB评分升高;与A组比较,B、C组BBB评分降低(P均<0.05)。与同组移植前比较,其余3组SEP、MEP潜伏期短;与A组比较,B组SEP潜伏期长,C、D组SEP潜伏期短;与A组比较,其余3组MEPP潜伏期短;P均<0.05。与其余3组比较,A组损伤区面积小(P均<0.05)。与D组比较,其余3组GFAP阳性细胞百分比低,GAP-43、BDNF阳性细胞百分比高;与A组比较,GFAP阳性细胞百分比高,GAP-43、BDNF阳性细胞百分比低;P均<0.05。结论 BMSCs与ChABC联合移植对大鼠脊髓损伤有修复作用,机制可能与其降低GFAP、GAP-43表达及升高BDNF表达有关。