肝素黄杆菌硫酸软骨素酶AC的高效重组表达体系构建及其酶学性质研究

为实现硫酸软骨素酶AC(chondroitinase AC,ChonAC)在大肠杆菌中高效表达,通过PCR方法从肝素黄杆菌(Pedobacter heparinus)中扩增得到ChonAC基因cslA,采用融合蛋白技术构建麦芽糖结合蛋白(maltose-bindingprotein,MBP)与ChonAC的融合表达载体(MBP-ChonAC),并在低温(15℃)条件下实现MBP-ChonAC的可溶活性表达,通过MBPTrap HP可实现一步纯化,使纯度可达95%以上,酶比活力可达94.1IU/mg融合蛋白(即相当于143.8IU/mgChonAC蛋白当量)。对MBP-ChonAC的酶学研究发现,其最佳催化pH值为7.5～8.0,最佳Ca2+浓度为20mmol/L,最适NaCl浓度为50mmol/L,最佳作用温度为20～35℃。MBP-ChonAC具有较好的热稳定性,在30℃时其半衰期可达8.3h。同时对其以硫酸软骨素A为底物的动力学常数测定发现,MBP-ChonAC相比ChonAC其Km稍有增大而催化常数kcat稍有降低,但是差别不大,表明MBP的融合没有对ChonAC的催化能力造成影响。通过宿主优化、诱导浓度优化及培养基优化进一步提高了MBP-ChonAC的表达量,其摇瓶培养酶活力就可达10800.5IU/L。