硫酸铵盐析法分级分离大豆酸沉蛋白

利用硫酸铵盐析法分级分离大豆中的酸沉蛋白,并通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳技术进行分析,初步确定可达到分级分离效果时的硫酸铵溶液饱和度。

低温乙醇法和硫酸铵盐析法制备的抗人T细胞猪免疫球蛋白与同类型兔源性制品体外活性的比对

目的比较低温乙醇法和硫酸铵盐析法制备的抗人T细胞猪免疫球蛋白(anti-human T lymphocyte porcine immunoglobulin,P-ATG)与市售的抗人胸腺细胞及抗人T细胞兔免疫球蛋白的体外活性,以评价两种工艺制备的P-ATG的性能。方法采用乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)法检测4种制品杀伤靶细胞的抗体依赖细胞介导的细胞毒作用(antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity,ADCC)效应;CCK-8法检测4种制品杀伤靶细胞的补体依赖性细胞毒作用(complement dependent cytotoxicity,CDC)效应;细胞双重免疫荧光标记法检测4种制品与不同T细胞抗原(CD3、CD4、CD8)的共定位情况。结果4种制品中,仅抗人胸腺细胞兔免疫球蛋白在高浓度(1 mg/mL)下对人外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC)有较弱的ADCC效应;4种制品均可介导人PBMC产生CDC效应,且呈剂量依赖性,其中抗人胸腺细胞兔免疫球蛋白的活性较高,为两种工艺制备的P-ATG或抗人T细胞兔免疫球蛋白的3~4倍,抗人T细胞兔免疫球蛋白的活性与P-ATG相当;4种制品与T细胞表面抗原CD3、CD4的共定位细胞比例相近,抗人胸腺细胞及抗人T细胞兔免疫球蛋白与CD8抗原共定位的细胞比例略低于两种工艺制备的P-ATG。结论低温乙醇法与硫酸铵盐析法制备的P-ATG体外活性具有良好的一致性,且在临床剂量下不低于进口同类型制品。

低温乙醇法与硫酸铵盐析法制备抗人T细胞猪免疫球蛋白的质量对比研究

目的采用低温乙醇法试制抗人T细胞猪免疫球蛋白(anti-human Tlymphocyte porcine immunoglobulin,P-ATG),并对最终制品与原硫酸铵盐析法工艺制品进行质量对比研究,评价其质量特性。方法采用《中华人民共和国药典》(简称《中国药典》)2015版(三部)中关于P-ATG的制品质量标准及扩展质量研究对商业化规模3批原硫酸铵盐析法及3批低温乙醇法P-ATG制品进行质量对比研究。结果3批低温乙醇法制品与硫酸铵盐析法制品均达到《中国药典》2015版(三部)中制品质量标准;扩展研究中,2种工艺制品的远紫外CD均值为93.43%,近紫外CD均值为97.68%,远紫外/近紫外CD相似度CV值均<0.5%;热稳定性结果显示,2种工艺制品的T_(m)值除T_(m2)外(P=0.031),差异均无统计学意义(P>0.05)。表明低温乙醇法工艺稳定性良好,批间差异较小,与硫酸铵盐析法具有良好的可比性。结论采用低温乙醇法可获得品质良好的P-ATG制品,可作为P-ATG的生产工艺。

低温乙醇法和硫酸铵盐析法制备抗人T细胞猪免疫球蛋白的非临床安全性评价

目的采用低温乙醇法制备抗人T细胞猪免疫球蛋白(anti-human T lymphocyte porcine immunoglobulin,P-ATG),并对其进行多项非临床研究,同时与原硫酸铵盐析工艺制品(市售制品)进行非临床对比研究,评价2种制品在毒理特性方面的一致性。方法给予新西兰兔的血管重复刺激性试验,评价2种制品对注射部位的局部反应;新西兰兔红细胞的体外溶血试验,评价2种制品的溶血性;单次给药静脉注射SD大鼠进行毒性试验,评价2种制品的急性毒性;4周重复给药静脉注射SD大鼠进行毒性并伴随局部刺激性、免疫原性和毒代动力学试验,评价2种制品的长期毒性。结果2种工艺制品连续5 d静脉注射新西兰兔,未见局部刺激性;2种工艺制品体外对新西兰兔红细胞无溶血作用,不引起新西兰兔红细胞凝聚;供试品组(低温乙醇法)在累计剂量1560 mg/kg和市售对照组(硫酸铵盐析法)在累计剂量1640 mg/kg的情况下,单次静脉注射SD大鼠产生的急性毒性反应相同,未显示出明显毒性,P-ATG(低温乙醇法)最大耐受量(maximum tolerance dose,MTD)>1560 mg/kg,为等效剂量的10.4倍,临床拟用剂量的62.4倍;供试品组(低温乙醇法)低、中、高剂量组分别在每日剂量195、310、780 mg/kg的情况下,重复静脉注射SD大鼠未出现明显毒性;供试品组(低温乙醇法)中剂量组在每日剂量310 mg/kg和市售对照组(硫酸铵盐析法)在每日剂量410 mg/kg的情况下,重复静脉注射SD大鼠产生的毒性特征基本一致,毒性结果变化趋势也较为接近,P-ATG(低温乙醇法)的未见明显毒性作用剂量(no observed adverse effect level,NOAEL)为780 mg/kg,为等效剂量的5.2倍,临床拟用剂量的31.2倍。结论低温乙醇法制品和硫酸铵盐析法制品的毒理特性具有良好的一致性。

发酵液中纳豆激酶盐析法分离的研究

就纳豆激酶 (Nattokinase)的粗纯化方法进行了初步的研究 .从初筛的 10株纳豆杆菌 (Bacillusnatto)中筛选出一株高产纳豆激酶的菌株 ,用液体发酵法将其发酵 ,产生的纳豆激酶采用硫酸铵盐析法进行粗提纯 .实验结果表明 ,硫酸铵盐在 70

发酵液中纤溶酶盐析法分离纯化的研究

作者分离出一株能产纤溶酶的芽孢杆菌菌株,用液体发酵法将其发酵,对纤溶酶的纯化方法进行了初步的研究。产生的纤溶酶采用硫酸铵盐析法进行粗提纯,使用超滤脱盐的方法纯化。结果如下:硫酸铵盐在70%饱和度时提纯效果较好,工作压力为0.11MPa超滤脱盐后,粗纤溶酶纯化倍数达到12.41,活性回收率为74.35%。

改良盐析法和传统盐析法提取绵羊血清γ—球蛋白的比较试验

动物血中的γ-球蛋白几乎都是免疫性抗体,具有抗菌、抗病毒、中和毒素和刺激生长等作用.医学界利用人胎盘血或人血浆提取γ-球蛋白并应用于临床取得较佳的效果.随着免疫学的发展,国内外兽医科学工作者也越来越重视提取和利用动物血液中的生物活性物质,其中包括γ-球蛋白的提取和利用.从动物血液中提取γ-球蛋白的方法很多,有低温乙醇沉淀法、利凡诺(Rivanol)法、硫酸铵盐析法等.但目前在国内,无论实验室提取,还是工厂化大生产,多仍采用硫酸铵盐析法这个较古老的提取方法.如何提高制剂中γ-球蛋白的含量、降低杂蛋白及其它杂质的含量、简化生产工艺、降低生产成本,是兽医生化制药工作者所关心的.

改良丙酮沉淀法用于天花粉蛋白的提取

随着天花粉蛋白(TCS)在临床性研究的不断进展,天花粉蛋白的生产工艺也越来越受到人们的重视。分别利用硫酸铵盐析法和改良丙酮沉淀法对天花粉蛋白的提取和工艺进行了比较分析,硫酸铵盐析法提取天花粉蛋白过程中操作复杂,提取率低,仅为0. 464‰;改良丙酮沉淀法操作简便,可短时间多次提取天花粉样品,提取率为1. 152‰,提取效果明显优于传统的硫酸铵分级沉淀法。由此表明改良丙酮沉淀法更适合天花粉蛋白质的研究。

低温乙醇法提取牛、羊血清γ—球蛋白的批量生产试验报告

从血液提取γ—球蛋白的方法很多,诸如有机溶剂沉淀法,盐析法,利凡诺尔法等,但在生产上真正有意义的仍属低温乙醇法和硫酸铵盐析法。我们根据医学界的有关材料,经过反复试验研究,利用肉联厂的冷库条件,采用低温乙醇法提取牛、羊血液γ-球蛋白获得成功。从小试的结果可以看出,采用低温乙醇法提取γ-球蛋白具有纯度大、得率高、产品不易污染、生产周期短、成本低等优点,从而可获得明显的经济效益。在小试的基础上,从1985年下半年开始又在海南肉联厂扩大试验,制订出工艺路线和工艺过程,进行工厂化批量生产试验,同样取得了较好的结果。现报告如下。

昆虫融合抗冻蛋白提取方法的比较

目的对用低温乙醇法、硫酸铵盐析法及等电点法提取的昆虫融合抗冻蛋白EGFP-OcAFP4浓度和蛋白相对得率进行比较。方法选取不同终浓度的乙醇(5%~65%)、硫酸铵(0.2~3.0 mol/L)及pH(5.6、5.4、5.2、5.0、4.8、4.7、4.6、4.5、4.4)提取重组质粒pET28a-EGFP-OcAFP4诱导表达液破菌上清中的EGFP-OcAFP4,并检测其纯度及蛋白相对得率。结果乙醇终浓度为30%时提取EGFP-OcAFP4的纯度最高,达86.21%,蛋白相对得率为6.89%;硫酸铵终浓度为2.0 mol/L时提取EGFP-OcAFP4的纯度最高,达42.33%,蛋白相对得率为30.83%;pH为5.0时提取EGFP-OcAFP4的纯度最高,达15.46%,蛋白相对得率为11.97%。结论低温乙醇法、硫酸铵盐析法和等电点法均可用于EGFP-OcAFP4的提取,但低温乙醇法和硫酸铵盐析法提取蛋白的纯度及相对蛋白得率更高,更适用于EGFPOcAFP4的提取。

孔雀IgG与鸡IgG的初步比较研究

通过比较孔雀 Ig G与鸡 Ig G的相似性 ,证实鸡疾病诊断试剂用于孔雀疾病诊断的可行性。用饱和硫酸铵盐析法提纯鸡 Ig G、孔雀 Ig G,比较 Ig G粗提物的 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳图谱。用直接 EL ISA方法分析孔雀 Ig G、鸡 Ig G与抗鸡 Ig G结合程度的差异 ,并用蛋白免疫转印法进一步验证二者与抗鸡 Ig G的结合情况。最后 ,应用数种鸡疾病诊断试剂盒及血凝抑制实验进行孔雀疾病的血清学调查及诊断应用初步研究。结果表明 :孔雀 Ig G与鸡 Ig G具有较大相似性 ,并能够与兔抗鸡酶标二抗结合 ,但结合力弱于鸡 Ig G;

一种稳定的IgA-VcA质控物的制备和应用

我们采用硫酸铵盐析法粗提免疫球蛋白,用含1%牛血清白蛋白的 pH6.8,0.01M PBS 稀释,获得稳定的高效价的IgA-VcA 质控物。现已应用于本室室内质控和作为阳性对照配备 EB 病毒血清学诊断试剂盒。1 IgA-VcA 质控物的制备收集临床上经病理诊断为鼻咽癌 IgA-VcA 滴度≥1:320的混合血清30 ml,用半饱和硫酸铵盐析法获得30 ml粗提全球蛋白溶液,测定效价后用上述 PBS 稀释,加0.01%硫柳汞防腐,分装聚乙烯小管加盖密封,-20℃保存备用。2 结果和讨论2.1 粗提免疫球蛋白(Ig)的回收情况采用琼脂糖单向免疫扩散法回收,本法对血清中总 Ig和 IgA 的回收率分别为58.98%、105.49%(见表1)。

菊芋蛋白的提取及其降血糖作用研究

目的 :比较菊芋蛋白两种提取方法的蛋白质提取率,并做菊芋蛋白降血糖研究。方法 :菊芋采用丙酮沉淀法和硫酸铵盐析法提取蛋白质,以蛋白质含量为指标,优选蛋白质提取率高的提取方法,并通过小鼠体内降血糖实验,评价菊芋蛋白的降血糖效果。结果:丙酮沉淀法蛋白提取率为11.30%,硫酸铵盐析法提取率为10.80%;降糖作用研究表明,菊芋蛋白高剂量组降血糖作用明显。结论:丙酮沉淀法提取率高,菊芋蛋白具有降血糖的效果。

盐析法与低温乙醇法制备抗人T细胞猪免疫球蛋白工艺的对比

目的两种常用抗人T细胞猪免疫球蛋白(anti-human T lymphocyte porcine immunoglobulin)制备工艺的对比。方法以人T淋巴细胞免疫的健康猪血浆为原料,采用硫酸铵-Sephadex A-50和Cohn低温乙醇法,经醛化人健康红细胞、醛化人胎盘渣及混合人血浆吸收后,制备抗人T细胞猪免疫球蛋白,参考《中国药典》三部(2010版)相关附录,进行中间品及成品检定。结果用硫酸铵盐析法与低温乙醇法连续分别制备了3批产品,每批投浆量约5 000 ml;3批中间品鉴别试验及3批成品检定结果均符合《中国药典》三部(2010版)相关要求,两种工艺方法均适用于制备抗人T细胞猪免疫球蛋白,但在质量和收获率上,低温乙醇法更具优势。结论低温乙醇法制备抗人T细胞猪免疫球蛋白更适用于生产。

纳豆激酶的分离纯化及其特性研究

从实验室保存的1株高产纳豆激酶菌株出发，进行发酵产酶，确立具有纤溶活力的纳豆激酶的分离纯化工艺，主要通过硫酸铵分级盐析法和Phenyl Sepharose疏水柱层析进行分离纯化，用纤维蛋白平板法测定酶活力，用SDS—PAGE电泳验证为电泳纯，分子质量为28ku。试验了不同作用温度、pH值和金属离子对NK活力的影响。结果表明，NK的适宜温度为25～50℃，适宜pH值为7．0，Cu^2＋，Mn^2＋，Hg^2＋是其抑制剂，而Mg^2＋，Ca^2＋为激活剂。

凝血因子及其他血浆蛋白的研究与生产

自1948年第一次报道用硫酸铵盐析法从血浆中分离到白蛋白和球蛋白以来,已经有100多年的历史了。1946年Cohn报道了一种低温乙醇法(Cohn 6法),在低温条件下,改变乙醇浓度、离子强度和pH值,使血浆蛋白逐步分离,得到5个组份,从而开创了血浆分层的新纪元。Pool 1965年报道了血浆冷沉淀物含有凝血因子Ⅷ(FⅧ)活性,为甲型血友病治疗开辟了途径。70～80年代。

血红细胞超氧化物歧化酶制备的研究

目的建立一种从血红细胞制备超氧化物歧化酶(SOD)的方法。方法由血红细胞自溶液60℃热变性,乙醇-氯仿法除血红蛋白,旋转蒸发法减压浓缩抽取氯仿、乙醇,硫酸铵分级盐析法沉降SOD,SepbadexG-75层析提纯SOD等步骤构成。结果热对SOD活性稳定性的影响及血细胞自溶液加热操作对SOD收率和纯化有影响,显示在血细胞自溶液这一环节采用热变性法,不仅起到了纯化作用,而且提高了抽提收率。结论该方法是一条成本低、设计合理、简便实用的分离纯化SOD的路线。

猪病毒性腹泻卵黄抗体提取纯化工艺的研究

为了研究适合于规模化制备卵黄抗体的联合方法,试验采用水稀释辛酸法,同时结合超滤法和硫酸铵盐析法,最终分离、纯化出目的蛋白。试验考察研究了不同比例水稀释液和辛酸对卵黄抗体除脂效果的影响,以及超滤液温度、p H值,截留分子质量和超滤压力对超滤效果的影响,并以单因素试验初步确定操作条件范围,L9(34)正交试验确定超滤条件的最佳参数。结果表明:分离出的卵黄液加入9倍纯化水和1%辛酸时除脂效果最好;超滤卵黄上清液的温度为25℃,p H值为7.5,采用截留分子质量为50 ku的膜包,超滤压力为0.025 MPa时,获得的浓缩液再经硫酸铵盐析,卵黄抗体提取率可达到90%,纯度为95%。