乌桕硬脂酰-酰基载体蛋白脱饱和酶基因的克隆及表达

硬脂酰-酰基载体蛋白脱饱和酶是植物脂肪酸合成代谢的关键酶,直接调节膜脂和贮脂中饱和脂肪酸和不饱和脂肪酸的比例。本研究通过RT-PCR及RACE技术,克隆乌桕硬脂酰-酰基载体蛋白脱饱和酶(SsSAD)的cDNA全长序列。结果显示,该序列包含1个1191 bp的完整的开放阅读框(GenBank登录号为EF079655),编码396个氨基酸,含33个氨基酸的叶绿体转移肽。其成熟肽含有363个氨基酸,推测其分子量为41.5 kDa,等电点为5.42。同源性分析及同源建模数据显示SsSAD和其它物种的SAD有较高的同源性,含有1个保守结构域。构建原核表达载体pMAL-SsSAD,转入大肠杆菌DH5α,并对诱导表达条件进行优化。

植物硬脂酰-酰基载体蛋白脱饱和酶

植物硬脂酰-酰基载体蛋白脱饱和酶(SAD)是植物脂肪酸合成代谢的关键酶,位于质体基质中,催化硬脂酰-ACP脱饱和形成油酰-ACP的反应。SAD决定着植物饱和脂肪酸和不饱和脂肪酸的比例,和植物响应温度变化,增强低温适应性有密切关系,并参与防御、膜形成等生理过程。SAD分子是同源二聚体,具特异的二铁中心,其空间结构已被描述。对SAD进行基因工程操作具有广阔的前景。

植物脂酰-酰基载体蛋白硫酯酶研究综述

植物脂酰-酰基载体蛋白硫酯酶(FAT)是一种终止脂肪酸合成的酶。它的基本功能就是将acyl-ACPs水解成游离脂肪酸和ACP,从而终止脂肪酸从头合成途径中脂肪酸链的延长。植物中,不同的FAT具有不同的底物特异性,直接决定植物细胞油脂中的脂肪酸的种类和数量。不同的植物组织和物种对于每种脂肪酸的需求各不相同,因此FAT在植物细胞代谢中就有着极为重要的作用。本文对FAT的种类、结构、功能、序列的分离克隆及其应用等方面进行综述。

油用亚麻可溶性糖、脂肪含量与硬脂酰-酰基载体蛋白脱氢酶基因表达相关性分析

为研究油用亚麻叶片、果球4个发育阶段硬脂酰-酰基载体蛋白脱氢酶基因(sad)表达水平与可溶性糖含量、脂肪含量之间的关系,以3个已知亚麻酸含量相对不同的油用亚麻品种为试验对象,应用q RTPCR技术对不同发育时期组织中sad基因的相对表达量与可溶性糖含量以及脂肪含量之间的关系进行分析。结果表明,在油用亚麻叶片和果球的不同发育阶段sad基因的表达模式符合正态分布,在品种和时期之间表达量差异明显。可溶性糖的含量在果球和叶片中差异明显,相关性分析结果显示,在sad基因表达量增加时,可溶性糖含量相对减少;脂肪含量与sad基因的表达量呈极显著正相关。油用亚麻中sad基因表达直接影响油用亚麻可溶性糖和脂肪含量,进而影响亚麻油的品质。

油茶SAD基因原核表达载体构建

为研究油茶种子SAD基因的预期功能,以报道的油茶SAD的CDS为模板设计引物,RT-PCR及TA克隆获得含有酶切位点的CDS片段。经过PCR及测序验证序列的正确性后,将PCR扩增产物双酶切后与同样经双酶切的原核表达载体pET30a连接,转化BL21(DE3)菌株。菌液PCR所得条带与预期一致,对于重组质粒的双酶切后2类产物电泳的条带分布符合经验分布规律。多种鉴定结果表明已成功构建适宜于原核表达用的重组载体。

向日葵HaFATA基因的生物信息学和表达分析

FATA编码脂酰-酰基载体蛋白硫酯酶A,将质体中以脂酰-ACP形式存在的脂肪酸水解成游离的脂酰-CoA和酰基载体蛋白。为了解向日葵HaFATA基因编码蛋白的结构、功能及基因表达特性,对HaFATA编码蛋白进行生物信息学和基因表达分析。预测HaFATA为碱性且为亲水性蛋白,二级结构主要是无规则卷曲,预测亚细胞定位于叶绿体。系统进化分析表明,HaFATA与同属菊科的莴苣(Lactuca sativa L.)和水飞蓟(Silybum marianum L.)FATA进化关系近,序列相似性分别为90%、87%。HaFATA表达分析结果显示,HaFATA在向日葵种子中表达最高,其次为在管状花和叶中,在茎、舌状花和根中不表达,在发育的种子中,HaFATA除在开花后12 d表达相对较低,在其他6个发育时期表达均较高,表明其对于种子发育和油脂积累可能具有重要作用。

澳洲坚果光壳种MiSAD的克隆与表达

澳洲坚果果仁中含有丰富的不饱和脂肪酸(unsaturated fatty acid,UFA),其不饱和脂肪酸生物合成的分子机制还有待进一步解析。植物硬脂酰-酰基载体蛋白脱饱和酶(SAD)是脂肪酸生物合成途径中形成不饱和脂肪酸的关键酶。本研究以澳洲坚果(Macadamia integrifolia)光壳种为对象,通过PCR技术克隆获得澳洲坚果硬脂酰-酰基载体蛋白脱饱和酶基因(MiSAD),并对结构功能和表达模式进行了初步分析。结果显示,克隆获得5923 bp的MiSAD基因组DNA序列,该基因由3个外显子2个内含子组成,包含1191 bp的编码框,与公布的粗壳种MtSAD序列高度一致;编码396个氨基酸;MiSAD分子量为45.22 kDa,等电点为5.93,属于酰基-ACP脱饱和酶,是位于叶绿体或质体基质中的水溶性酶;高度保守的区域存在形成酶活位点的2个E-X-X-H二铁原子中心基序,N端和C端氨基酸序列差异较大;二级结构中以α-螺旋和无规则卷曲为主;三级结构预测中存在形成脂酰链结合部位的螺旋-转角-螺旋(HTH);与蒂罗花的同源性最高达94.2%,与其他物种的SAD同源性也都在80%以上;分子进化树显示与荷花进化关系较近,属于植物脂酰-ACP脱饱和酶。荧光定量PCR数据显示MiSAD在根、茎、叶、花、果中均有表达,其中叶片和果实中表达量较高,果实中的MiSAD表达量在开花后第100天左右达到最高,之后随着果实的成熟逐渐下降,呈现正态分布趋势。该研究为深入研究MiSAD在澳洲坚果果仁中不饱和脂肪酸生物合成的作用机制奠定基础。

黄连木PcSAD基因的克隆及分析

中国黄连木(Pistacia chinensis Bunge)是种重要的优良木本油料树种,分布广,而且种子具有含油量高、出油率高、油品质好等优点,是生产生物柴油的理想原料。硬脂酰-酰基载体蛋白脱饱和酶(stearoyl-ACP desat-urase,SAD)在植物中催化不饱和脂肪酸生物合成的第一步脱饱和反应,对植物细胞膜和种子油脂中脂肪酸成分的调控起着重要作用。本研究采用RACE及RT-PCR方法,首次从黄连木种子中克隆获得长度为1791bp的SAD基因(命名为PcSAD),该基因含有1299bp完整的开放阅读框、编码432个氨基酸。生物信息学分析发现,黄连木PcSAD基因的核苷酸序列及其编码的氨基酸序列与已报道的其它相近物种具有较高同源性,而且PcSAD含有典型的酰基载体蛋白脱饱和酶2和类铁蛋白家族的保守结构域;另外,开展了PcSAD的原核表达载体构建及诱导表达体研究。上述研究结果可为黄连木PcSAD基因的功能鉴及应用定奠定重要基础。

油茶脂肪酸代谢途径中关键酶基因调控油脂合成的规律研究

以国审油茶"华硕"和普通油茶"望城1号"不同发育时期种仁为材料,分析种仁含油率、脂肪酸成分和脂肪酸代谢关键酶基因表达规律。结果表明,油茶酰基载体蛋白基因(CoACP)、硬脂酰脱饱和酶基因(CoSAD)和油酸脱氢酶基因(CoFAD2)表达规律与油茶种仁成熟程度有关而与品种关系不大;"华硕"较"望城1号"生殖发育期长,成熟期晚,脂肪酸各成分变化幅度大,采收期可比"望城1号"延迟1个月;10月底采收时虽然"华硕"含油率低于"望城1号",但不饱和脂肪酸含量却高些,若延迟采收"华硕"可保产量质量均优。

麦醇溶蛋白-雷帕霉素复合纳米颗粒治疗乳糜泻的探索研究

目的设计制备搭载麦醇溶蛋白(Gliadin)-雷帕霉素(Rapamycin,Rapa)的复合纳米颗粒,经结构表征、稳定性、缓释特性等研究优选处方,测试其对乳糜泻相关过敏反应的免疫耐受治疗作用。方法本研究利用沉淀自组装法制备聚合物脂质杂化纳米粒(PLNs),载药后超滤离心法得到浓缩纳米药物水溶液;透射电镜观察其形态;激光粒度分析仪考察粒径、Zeta电位和稳定性;BCA蛋白定量测试及分光光度计考察包封率;透析袋法考察其体外释药特性;迟发超敏反应考察其免疫抑制效应。结果制备的PLN ^(Gliadin)、PLN^(Rapa)及PLN^(Gliadin+Rapa)纳米粒形态规整,分布良好,粒径分别为(198.04±10.98)nm、(70.73±6.51)nm、(200.98±0.77)nm;Zeta电位分别为(-29.71±5.67)mV、(-41.55±1.13)mV、(-44.80±4.93)mV;PLN ^(Gliadin)及PLN^(Gliadin+Rapa)的Gliadin包封率分别为(43.05±3.35)%与(41.79±4.93)%;PLN ^(Rapa)及PLN^(Gliadin+Rapa)的Rapa包封率分别为(38.05±6.26)%和(26.13±1.30)%。三种PLNs纳米药物缓释特性明显;药效学试验结果表明三种PLNs纳米药物均能降低由Gliadin刺激造成的足底肿胀超敏反应,PLN^(Gliadin+Rapa)效果最显著,且两次预防治疗比单次预防治疗效果好。结论搭载Gliadin-Rapa的PLNs递送体系结构稳定,缓释作用突出,能有效抑制乳糜泻相关的过敏反应,是治疗乳糜泻的潜在方法。