基于硼酸亲和色谱(BAC)测定单抗糖化比例方法的建立

目的:建立基于硼酸亲和色谱(BAC)测定单抗糖化比例分析方法并进行方法学验证。方法:对硼酸亲和色谱做方法优化和方法学验证,通过对流动相的盐组成、NaCl和Tris浓度的优化,建立能够有效定量单抗糖化比例的BAC分析方法,并对该方法进行方法学验证和应用评价。结果:NaCl和Tris浓度的变化会影响单抗糖化比例的检测,通过参数优化,最终确定在NaCl和Tris浓度分别为300 mmol·L^(-1)和25 mmol·L^(-1)时,可以对单抗糖化比例进行准确定量。根据ICH Q2和《中华人民共和国药典》2020年版对建立的方法进行了方法学验证,结果表明该方法具有良好的特异性、准确性、精密度和耐用性。单抗糖化比例在2%~90%有良好的线性,R^(2)大于0.99,回收率在87.04%~115.29%;非糖化比例在10%~98%具有良好线性,R^(2)大于0.99,回收率在99.69%~109.79%。精密度结果表明,该方法整体的RSD值小于18.26%。最后,利用建立的方法对利妥昔单抗原研药和生物类似药进行了糖化比例检测,发现同一厂家不同批次利妥昔单抗糖化比例差异较小,而不同厂家糖化比例存在差异。结论:建立的BAC糖化比例测定方法具有良好的准确性和精密度,可用于利妥昔单抗糖化比例的检测。

硅胶基硝化苯硼酸亲和色谱材料的合成及应用

合成了硅胶基硝化苯硼酸亲和色谱材料,首先对间氨基苯硼酸进行硝基化,制得3-氨基-4-硝基苯硼酸功能基团,通过γ-缩水甘油醚氧丙基三甲氧基硅烷把功能基团键合到硅胶基体上,在20.7MPa压力下装成亲和色谱预柱(35mm×4.6mmi.d.)。用该预柱通过六通阀后接ODS分析柱(250mm×4.6mmi.d.),构成中心切割二维HPLC。该系统能对含有顺二羟基结构的化合物进行在线富集,实现生物复杂样品直接进样分离分析。使用该系统对尿中多种修饰核苷进行了分离分析,以pH值7.95的0.25mol/LNH4Ac碱性缓冲液把实际尿样(100μL)中核苷保留在预柱上,生物大分子无保留通过,再切换六通阀,以pH4.50的25mmol/LKH2PO4酸性洗脱液把保留在预柱上的核苷洗脱,进样到下一级ODS分析柱柱头上聚焦,然后用梯度洗脱法(pH4.50的25mmol/LKH2PO4缓冲液与体积比60∶40的甲醇-水梯度混合构成洗脱液)完成核苷在ODS分析柱上的分离(紫外检测260nm),11种目标核苷的分离分析取得了良好的定性定量结果。

免疫透射比浊法与硼酸亲和层析法测定HbA1c结果比较

糖化血红蛋白（HbAlc）是临床评价糖尿病患者血糖水平的重要指标，检测患者的HbAlc水平能有效评估患者采样前3～6个月的血糖水平。糖尿病患者因为不能控制好血糖水平。而导致病死率增加以及不能及时发现并发症的几率增加，给患者带来很大阴影。

基于巯基-烯点击反应制备有机-无机杂化硼酸亲和整体柱用于糖蛋白的选择性富集

发展了以巯基-烯点击反应制备有机-无机杂化硼酸亲和整体柱的新方法。首先以四甲氧基硅烷(TMOS)和巯丙基三甲氧基硅烷(MPTMS)作为反应单体,采用溶胶-凝胶反应制备表面含巯基的硅胶整体柱。然后利用巯基-烯(thiol-ene)的点击反应在整体柱上修饰硼酸配基3-丙烯酰胺基苯硼酸(AAPBA),制成AAPBA-硅胶杂化亲和整体柱。对影响硼酸亲和整体柱性能的条件如TMOS与MPTMS的比例、聚乙二醇和甲醇的用量等进行了优化。并采用扫描电镜、红外光谱等分析仪器对整体柱形貌和机械稳定性能进行了表征。研究了AAPBA-硅胶杂化亲和整体柱的分离性能,结果表明,其在中性条件下对含有顺式二醇的生物小分子核苷具有良好的特异亲和能力,并已成功地应用于卵清蛋白、辣根过氧化物酶等糖蛋白的分离。基于巯基-烯反应的制备方法新颖、可靠,可用于制备多种不同类型的硼酸亲和整体柱,具有较大的应用前景。

硼酸亲和整体柱在富集中药活性物质中的应用

以4-乙烯基苯硼酸(VPBA)为功能单体,季戊四醇三丙烯酸酯(PETA)为交联剂,乙二醇和二甘醇为二元致孔剂,通过热引发自由基聚合反应,在毛细管内原位聚合制备得到一种poly(VPBA-co-PETA)毛细管整体柱。所制备的整体柱具有典型的硼酸亲和特性,可以特异性地捕获含有顺二羟基的化合物。在前期实验的基础上,将其用于两种中草药蒲公英和刺果卫矛中含顺二羟基的小分子活性物质的富集。这两种中药提取物直接用高效液相色谱进行检测时,其活性成分绿原酸等因含量太低而使检测困难或无法检测;经过硼酸亲和整体柱富集后收集洗脱液进行检测,色谱峰响应则显著提高。该结果表明所制备的poly(VPBA-co-PETA)整体柱可以作为富集中药提取物中含顺二羟基活性物质的有效手段。

硼酸亲和杂化毛细管整体柱选择性富集蒲公英中的活性物质

以四乙氧基硅烷,N-氨乙基-3-氨丙基三乙氧基硅烷,3-甲基丙烯酰氧丙基三甲氧基硅烷作为前驱,4-乙烯基苯硼酸为单体,在毛细管中原位制备硼酸亲和杂化整体柱,该柱可在中性条件下选择性的富集顺式二羟基生物分子,实现了对蒲公英中活性成分咖啡酸及绿原酸的选择性富集。

基于硼酸盐亲和辅助电化学调控ATRP的癌胚抗原超灵敏电化学适体传感研究

癌胚抗原(CEA)是一种酸性糖蛋白,其作为一种广谱肿瘤标志物在恶性肿瘤的鉴别诊断与监测等方面具有重要价值。在此,借助于硼酸盐亲和辅助电化学调控原子转移自由基聚合(BA-eATRP)的双重信号放大作用,我们报道了一种电化学适体传感器,用于CEA的超灵敏、高选择性检测。基于BA-eATRP的电化学CEA适体传感的基本原理为:待核酸适体捕获CEA抗原后,借助于苯硼酸(PBA)基团与单糖残基上的顺式二醇基团间的选择性亲和相互作用将ATRP引发剂位点靶向性地共价偶联到CEA抗原上;随后,以二茂铁甲基丙烯酸甲酯(FcMMA)作为单体,借助于eATRP将二茂铁(Fc)探针引入电极表面。由于CEA上含有数百个顺式二醇基团,基于硼酸盐亲和的交联反应可使得在每个CEA抗原上标记数百个ATRP引发剂分子。此外,通过eATRP反应,可以在电极表面接枝长的二茂铁基聚合物链,使得每个标记有ATRP引发剂的位点均能连接上成百上千个Fc探针。因此,BA-eATRP可使得每个CEA抗原上标记上大量的Fc探针。在最佳条件下,基于BA-eATRP的电化学适体传感器能够实现浓度低为0.34Pg·mL^(-1)的CEA的高选择性检测,其线性范围为1.0-1000pg·mL^(-1)。而且,该适体传感器可用于人血清中CEA的定量分析。基于BA-eATRP的电化学适体传感器具有成本低廉、操作简便等优良特性,在CEA的超灵敏、高选择性检测方面具有广阔的应用前景。

聚(4-乙烯基苯硼酸-季戊四醇三丙烯酸酯)亲和整体柱的制备与应用

以4-乙烯基苯硼酸为单体,季戊四醇三丙烯酸酯为交联剂,偶氮二异丁腈为引发剂,乙二醇和二甘醇为致孔剂,经原位聚合制备了聚(4-乙烯基苯硼酸-季戊四醇三丙烯酸酯)毛细管整体柱。以单体、交联剂、致孔剂和引发剂的用量为4种因素,最大吸附量、柱效和保留时间为3个考察标准,利用实验设计软件(DOE)优化了其合成条件,验证了正交实验最优结果,得到了整体柱合成的最佳配比为单体7.32 mg,交联剂6 mg,致孔剂100μL,引发剂1 mg。在最佳条件下合成整体柱,并进行表征,在微径液相色谱(μHPLC)和加压毛细管电色谱(pCEC)实验中考察了分离特性。结果表明,整体柱固定相表面的硼酸基团在碱性条件下能特异性吸附邻苯二酚、腺苷等含有邻二羟基结构的化合物,具有亲和色谱的特性;同时由于交联剂的性质使其具有反相分离机理,在含有20%有机相的条件下能够将极性不同的苯系物分开。

硼酸亲和层析法检测糖化血红蛋白A1c的效果评估

目的评估硼酸亲和层析法检测GHbA1c的临床效果。方法利用高效液相色谱法(HPLC(B法))硼酸亲和层析法(A法)同步盲测118例全血GHbA1c水平,计算二者的相关系数、灵敏度、特异性和总符合率,同时对溶血、黄疸等可能的干扰因素进行评估。结果两种方法的灵敏度、特异性和总符合率分别为100%、92.3%和97.1%,相关系数r为0.980,表明两种方法的检测结果具有较高的一致性和等效性。结论硼酸亲和层析法检测GHbA1c结果准确,用血量少,检测时间短,可随机检测,单标本独立检测,适合急诊、基层医疗机构、了解糖尿病患者病情和治疗效果的个人监测,具有很高的临床实用前景。

硼酸亲和材料的制备及其在生物样品顺式二醇类物质分析中的应用进展

顺式二醇类生物分子的分离检测在生物分析和疾病诊断上具有重要的意义。硼酸亲和材料与顺式二醇基团可发生可控的可逆共价键合反应,广泛应用于选择性地分离富集生物样品中顺式二醇类物质。本文讨论了硼酸亲和材料的萃取剂原理及其影响因素,对近年来国内外硼酸亲和材料的合成及其在生物样品中的应用进行了介绍。

大孔硼酸亲和材料的制备及其对左旋多巴的分离纯化性能研究

利用两步种球溶胀法制备带环氧基团的大孔树脂,将3-氨基苯硼酸修饰在大孔树脂表面,得到大孔硼酸亲和材料P_(GMA-HEMA-EGDMA)@APBA。使用扫描电镜,红外光谱对所制备材料进行表征,并通过静态吸附、动态吸附考察其吸附性能。结果表明,硼酸亲和材料对左旋多巴的最大吸附容量可达22.81μmol/g,具有较好的特异性吸附能力。动力学显示,材料对左旋多巴的吸附在50 min内迅速达到平衡,吸附行为符合准二级动力学方程。吸附等温线研究表明,实验数据拟合更符合Langmuir吸附等温模型,且吸附过程为放热。硼酸亲和材料对猫豆中左旋多巴的回收率可达88.9%,再生性能良好,有望应用于左旋多巴的分离与纯化。

桃叶珊瑚苷-硼酸共聚印迹整体柱的制备及其分子识别性能

以桃叶珊瑚苷为模板,4-乙烯基苯基硼酸为功能单体,制备了桃叶珊瑚苷-硼酸共聚印迹整体柱。考察了分子印迹整体柱的通透性、选择保留性能、吸附及固相萃取性能。结果表明,整体柱通透性好,当使用体积比为49∶1的甲醇-1%HCl混合溶液为流动相时,其对模板具有最强的保留能力和较高的选择性,容量因子高达166.4,选择因子最高达3.200。前沿分析表明整体柱的饱和吸附量达95.16 mg·g^(-1)。Scatchard分析显示印迹材料主要有两类吸附位点。当分子印迹柱用于从杜仲籽粨粗提物中分离纯化桃叶珊瑚苷时,可获得含量高于85%的产品。当整体柱用于分离分析时,方法的检出限和定量限分别为0.167 mg·kg^(-1)和0.547 mg·kg^(-1),且整体柱可重复使用。

抗生素的硼酸基亲和层析 I.红霉素和卡那霉素与硼酸络合可能性的研究

根据硼酸与糖等多羟基化合物能形成络合物的特性 ,本文研究红霉素和卡那霉素与硼酸络合的可能性 ,采用电导率法、1 1 B核磁共振波谱法、制备硼酸基亲和吸附剂进行实际吸附等方法。实验结果表明 ,红霉素不含顺式 1,2 -二羟基 ,虽能吸附 ,但吸附量较少 ,无实用价值 ;卡那霉素含顺式 1,2 -二羟基 ,络合的可能性大 ,有可能应用硼酸基亲和层析纯化。

亲和分离技术在蛋白质糖基化修饰研究中的应用进展

蛋白质糖基化是蛋白质最重要的翻译后修饰之一,糖基化过程的失调或紊乱与癌症、炎症性疾病、神经系统疾病等密切相关。分析和研究蛋白质糖基化的结构与功能,有望为探索疾病发生的分子机制、开发新的诊断依据和控制治疗用生物药物的质量提供重要信息。然而生物样品中糖基化蛋白质相对丰度低,样品基质复杂,故而适宜的分离技术必不可少。亲和技术具有良好的专一性和灵敏度,可有效实现蛋白质的分离富集,成为糖基化蛋白质结构与功能研究的有力工具,并在近期得到发展。本文介绍亲和分离技术在蛋白质糖基化修饰分析中的应用进展。

两种不同方法测定糖化血红蛋白的比较

目的比较硼酸亲和层析法(A法)与离子交换高效液相层析法(B法)在测定糖化血红蛋白中的差别,选择一种方便、快捷、准确、适合大批量及自动化的检测方法。方法 A法、B法分别采用硼酸亲和层析法和离子交换高效液相层析法,对两种方法的精密度、变异系数、相关性、甘油三酯的干扰等予以评价。结果 B法在SD、CV等方面的统计数据优于A法,而两种方法的相关系数r=0.98,表明两种方法有高度的相关性,并且高甘油三酯对两种方法均无明显影响。结论 A法人为影响因素大,但是无需特殊仪器,检测时间短,单独标本可随机检测,适合急诊、基层卫生机构的使用。而B法准确度及精密度高,可进行自动化控制,测量速度快。

血红蛋白异常对高效液相色谱法检测糖化血红蛋白的影响

目的探讨血红蛋白(Hb)异常对高效液相色法谱检测糖化血红蛋白(HbA1c)的影响。方法使用国内常用的硼酸盐亲和层析高效液相色谱法(PDQ系统)及离子交换层析高效液相色谱法(D-10系统)进行含有不同(梯度)浓度HbF与正常人血液混合的标本的干扰实验及检测40例Hb异常的临床标本中的HbA1c。结果在干扰实验中,D-10系统在HbF在浓度超过40%时,可能无法获得检测结果,当HbF浓度在10%～40%时,结果高于实际值,HbF在浓度低于10%时,结果与实际值相似;PDQ系统在HbF浓度超过40%时,结果可能略低于实际值,HbF浓度低于40%时,可以获得好的结果。在40例Hb异常的临床标本中,D-10系统检测结果明显高于PDQ系统,差异具有统计学意义(P<0.05),其中有5例Hb异常总量超过35%的标本在D-10系统中无法获得检测结果,而PDQ检测获得可接受的结果;Hb异常总量低于10%时,两种方法检测结果有较好的一致性(P>0.05)。结论硼酸盐亲和层析抗Hb异常的干扰能力优于离子交换层析。

氨基甲酰血红蛋白对3种糖化血红蛋白检测方法干扰研究

目的评估慢性肾脏疾病(CKD)5期患者糖化血红蛋白(HbA1c)检测结果受氨基甲酰血红蛋白(carHb)的影响。方法收集进行血液透析治疗的CKD5期患者92例,其中31例合并2型糖尿病(T2DM),分别使用毛细管电泳法(Sebia CapillarysTM2Flex Piercing)、离子交换高效液相色谱法(VariantⅡTurbo 2.0)和硼酸亲和层析法(Primus Ultra2)进行检测HbA1c。用广义估计方程用来分析不同测量方法之间的差异,作业相关矩阵设为复对称相关结构,进一步计算HbA1c的最小二乘均数,并以硼酸亲和层析法作为参比方法进行多重比较。结果 CKD5合并T2DM组中VariantⅡturbo 2.0检测HbA1c结果与参比方法比较差异无统计学意义(P>0.05);CKD5无T2DM组VariantⅡturbo 2.0检测HbA1c结果与参比方法比较差异有统计学意义(P<0.001),其差异为15.48%,有临床意义。CKD5合并T2DM组和无T2DM组,Sebia CapillarysTM2Flex Piercing检测HbA1c结果与参比方法比较差异均无统计学意义(P>0.05)。结论对CKD5患者,Sebia CapillarysTM2Flex Piercing检测HbA1c不受carHb的干扰,而VariantⅡturbo 2.0可能由于carHb的干扰会引起HbA1c假性增高。

乙酰化血红蛋白对高效液相色谱检测HbA_(1c)影响的探讨

目的探讨乙酰化血红蛋白对不同原理的高效液相色谱法检测血红蛋白A1c(HbA1c)的影响。方法用美国Primus公司出品的基于硼酸盐亲和层析法(PDQ系统)和由美国Bio-Rad公司出品的基于离子交换层析法的糖化血红蛋白检测系统(D-10系统)检测慢性肾功能不全患者40例,并对体外乙酰化标本进行检测。结果 D-10系统检测慢性肾功能不全结果高于PDQ系统,且差异有统计学意义(P<0.05),同时乙酰化血红蛋白干扰时,D-10系统的检测结果高于实际值,而PDQ系统的结果与实际值相符。结论血红蛋白乙酰化水平增高会影响D-10系统检测HbA1c,而PDQ则不受影响。

硼酸盐亲和色谱法测定HbA_1c效果评价

目的探讨使用硼酸盐亲和色谱法测定HbA1c的效果。方法采集46例糖尿病患者和20名健康体检者EDTA抗凝静脉血及指血标本,使用硼酸盐亲和色谱法测定HbA1c,并与Bio-Rad D-10糖化血红蛋白分析仪的测定结果进行对比,分析该法批内、批间变异及线性范围、回收试验、干扰试验等,探讨该法测定HbA1c结果的参考区间和诊断效能。结果硼酸盐亲和色谱法批内与批间平均变异系数分别为1.0%和1.8%,HbA1c在4.0%～15.0%浓度范围内呈线性关系;常见干扰物对本法无明显影响;本法与离子交换高效液相色谱法(HPLC)测定结果呈高度相关(P<0.01)。末稍血与静脉血样本测定结果具有一致性。健康人HbA1c水平的参考区间为4.2%～6.0%;以HbA1c 6.1%为切点,筛查糖尿病的敏感性为80.2%,特异性为87.6%。结论硼酸盐亲和色谱法测定HbA1c简便实用,准确性、精密度较高,干扰因素少。

硼酸盐亲和色谱法检测糖化血红蛋白的分析性能评价

目的评价硼酸盐亲和色谱法(AC-HPLC)检测糖化血红蛋白(HbA1c)的分析性能。方法参考美国临床与实验室标准化协会(CLSI)发布的方法学评价系列文件(EP文件)及相关文献,对Premier Hb9210系统检测HbA1c的精密度、正确度、分析测量范围以及生物参考区间进行验证,并与厂商声明的性能和有关质量标准进行比较。结果硼酸盐亲和色谱法检测HbA1c两个不同水平的批内精密度(CV%)分别为0.8%和0.6%;总精密度(CV%)分别为1.53%和0.9%。与离子交换高效液相色谱法(IE-HPLC)的VariantⅡ检测系统的相对偏倚为3.26%。与来源于美国国家糖化血红蛋白标准化计划(NGSP)定值样本靶值的相对偏差为2.3%~3.2%,HbA1c浓度为4.1%~16.4%,理论值与实测均值呈线性相关,回归方程为Y=1.0018x+0.3903,r2=0.9942。随机选择的20名健康参考个体糖化血红蛋白浓度均在厂商提供的参考区间内。结论Premier Hb9210糖化血红蛋白分析仪的主要分析性能达到了厂商声明的性能和有关的质量要求,适用于我室检测糖化血红蛋白。