碘化丙啶染色流式细胞术分析肿瘤细胞凋亡的方法学探讨

针对凋亡细胞的生物化学改变,已经建立了多种基于FCM来检测凋亡的方法。其中,碘化丙啶单染（propidium iodide,PI）单染法和PI/An-necxinⅤ双染法应用最为广泛。双染法可精确区分早期凋亡、晚期凋亡和坏死细胞。虽然PI单染法仅能检测到晚期凋亡和坏死细胞,但因操作简单、试剂廉价,更适合样本量大的预实验或新药筛选。

两种碘化丙啶染色DNA定量方法检测HL-60细胞凋亡结果的比较

碘化丙啶（propidium iodide,PI）是插入性核酸染料,直接插入双链核酸的2个碱基对之间,每5个碱基插入1个荧光分子,与核酸的结合均匀、稳定。细胞经过 RNA 酶处理后,PI 可以与细胞内 DNA 特异性结合,在流式细胞仪上经488 nm 激光激发,发出峰值610~620 nm 的荧光,可以准确的反映细胞群体中DNA 含量的分布情况,适用于 DNA 定量检测。

内皮素受体拮抗剂抑制异丙肾上腺素诱导大鼠心肌细胞搏动加速及凋亡

观察内皮素受体拮抗剂CPU0213能否阻断异丙肾上腺素(isoprenaline,ISO)所致大鼠心肌细胞搏动加速及凋亡。分离大鼠心肌细胞。给ISO(10-7M)的同时给CPU0213(10-7、10-6、10-5M),并以普萘洛尔(10-6M)作为阳性药对照,观察各组心肌细胞的搏动次数。采用吖啶橙/碘化丙啶(AO/PI)染色法检测成年大鼠心肌细胞凋亡率的变化。普萘洛尔明显抑制ISO效应(P<0.001)。内皮素受体拮抗剂CPU0213明显抑制ISO所致的心肌细胞搏动和细胞凋亡,且呈浓度依赖性。大剂量CPU0213对ISO生物效应的阻断作用(P<0.001)与普萘洛尔相仿。内皮素受体拮抗剂CPU0213阻断ISO所致的心肌细胞搏动加速和增加细胞凋亡率等生物学效应,提示内皮素介导β-受体效应。

器官型脑片糖氧剥夺模型的建立

目的在大脑皮质器官型脑片的基础上复制氧糖剥夺模型(OGD),模拟脑缺血损伤病理变化。方法采用膜插件方法制备大脑皮质器官型脑片,将脑片进行OGD干预后复氧复糖。观察不同时间点的碘化丙啶(PI)染色。结果实验组OGD前后PI染色荧光强度值有明显变化,各时间点荧光强度依次增强,与对照组对比差异均有统计学意义(P<0.05)。结论器官型脑片OGD模型模拟了缺血性脑损伤的病理变化,操作方便,可以作为研究缺血性脑血管病发病机制及治疗的模型。

piR -10555对心肌细胞坏死的调控作用及其机制

目的探讨PIWI蛋白互作RNA-10555(piR-10555)对心肌细胞坏死的调控作用及其机制。方法选用500μmol/L的过氧化氢(H 2 O 2)处理H9c2细胞0、6、12、24 h,应用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)技术检测H9c2细胞中piR-10555的表达水平。H9c2细胞分别转染piR-10555类似物agomir-piR-10555及转染piR-10555抑制剂antagomir-piR-10555后使用H 2 O 2处理,通过RT-qPCR方法检测H9c2细胞中piR-10555的表达,并使用碘化丙啶(PI)染色方法和乳酸脱氢酶(LDH)测定试剂盒检测细胞的坏死情况。结果在H 2 O 2处理24 h后,H9c2细胞中piR-10555的表达水平显著上调(F=14.51,P<0.05)。转染agomir-piR-10555以后,H9c2细胞中piR-10555表达水平明显升高(F=154.00,P<0.05),H9c2细胞的PI阳性率显著增加(F=32.61,P<0.05),H9c2细胞培养基上清液中的LDH活性明显提高(F=126.50,P<0.05)。转染antagomir-piR-10555后,H9c2细胞中piR-10555表达水平显著降低(F=33.31,P<0.05),PI阳性率显著下降(F=138.70,P<0.05),细胞培养基上清液中的LDH活性明显降低(F=58.60,P<0.05)。结论piR-10555可能参与调控由H 2 O 2诱导的H9c2细胞的坏死。

凋亡过程中膜联蛋白V（AnnexinV）的检测

1原理 细胞凋亡具的各种不同的形态学特征,细胞膜的改变是最早的变化之一.在凋亡细胞,位于细胞膜内的磷脂酰丝氨酸( phospholipid phosphatidyl-serine, PS)转位到细胞膜外.膜联蛋白V是一种35～36kDa的钙依赖的.磷脂结合蛋白,其与PS有高度的亲和性,能与表达ps的细胞结合.膜联蛋白可与萤光染料异硫氰酸FITC或生物素(biotin)结合.因此可用于流式细胞术检测凋亡过程中的细胞.

快速制备细胞周期样品方法评估和优化

该文对快速一步法与乙醇固定法制备流式细胞周期样品进行系统比较,并对快速制备方法进行优化。用碘化丙啶快速染色法制备细胞周期样品,平行比较该方法与乙醇固定方法制备样本的测试结果,评估快速样本制备方法的可靠性和样品放置时间对实验结果的影响。实验结果表明,快速染色法与乙醇固定法相比,细胞周期各时相细胞比例及CV值在统计学上均无显著差异,样品放置6天细胞周期各时相百分含量无显著差异,但CV值和荧光强度有明显改变,在快速染液中添加2%～4%血清,能够有效降低细胞粘度、提高高粘度样本的检测速度。

流式细胞术测定蠕形螨基因组大小

目的采用流式细胞术(FCM)测定蠕形螨基因组大小,为构建蠕形螨基因文库和筛选功能基因奠定基础。方法自然沉降法清洗收集蠕形螨,组织匀浆器和超声波破碎螨体,在柠檬酸介质中分离蠕形螨的细胞核。以家鸡血细胞核DNA含量为内标,用FCM测定经碘化丙啶(PI)染色的家鸡血细胞核和蠕形螨细胞核混合样品发出的PI荧光强度,通过比较蠕形螨与家鸡血细胞DNA含量峰值的倍数关系,计算出蠕形螨的基因组大小。结果采用FCM测得蠕形螨DNA含量约为1.05 pg/2C,以1 pg DNA相当于978 Mb计算得出蠕形螨基因组大小约为512 Mb。结论流式细胞术可快速、精确测定蠕形螨基因组大小,为蠕形螨基因组研究奠定了基础工作。

人锌指蛋白23在原发性肝细胞肝癌中的表达及临床意义

目的 分析hZNF23在人HCC组织及HepG2细胞系中的表达情况,以探讨其与HCC临床病理特征和细胞凋亡的关系.方法 采用实时荧光定量RT-PCR法检测37例HCC患者（按Edmondson分为两组,Ⅰ＋Ⅱ级17例,Ⅲ＋Ⅳ级20例;按临床分为3组,HCC合并肝硬化和HBV感染组31例,HCC合并肝硬化和HCC合并HRV感染组各3例）癌组织和其癌旁肝组织标本中hZNF23及内参GAPDH mRNA的表达水平,并分析其与HCC临床病理特征的关系;体外培养HepG2细胞后,分为4组（对照组、1.25、2.5和5 μg/ml顺铂组）或6组（对照组、1.25、2.5、5、10和20μg/ml顺铂组）.采用四唑盐比色法（MTT）和流式细胞仪膜联蛋白V/碘化丙啶染色法检测与观察HepG2细胞的增殖及凋亡情况;实时荧光定量RT-PCR法检测HepG2细胞在不同浓度的顺铂诱导凋亡后,hZNF23及内参GAPDH mRNA的表达水平.结果 37例HCC患者癌组织及其癌旁组织标本中hZNF23相对表达量分别为8.84（3.59～15.05）和22.20（13.85～42.90）,差异有统计学意义（U=259.5,P＜0.01）.Edmondson Ⅰ＋Ⅱ级HCC组织hZNF23 mRNA相对表达量为12.80（4.80～19.50）,高于Ⅲ＋Ⅳ级的5.01（2.88～11.68）,且差异有统计学意义（U=99.00,P＜0.05）;合并肝硬化组为9.92（3.80～15.25）,未合并肝硬化组为3.21（2.78～3.60）、合并HBV感染组为9.09（3.72～15.25）,无HBV感染组为2.48（1.79～12.10）,合并肝硬化组与未合并肝硬化组、合并HBV感染组与未合并HBV感染组比较,其hZNF23 mRNA表达量差异均无统计学意义（U值分别为16.00和24.00,P均＞0.05）.顺铂作用于HepG2细胞24 h后,用MTT检测,顺铂明显抑制HepG2细胞增殖;膜联蛋白V/碘化丙啶染色法检测细胞凋亡率依次为（0.9±0.2）%、（4.2±0.3）%、（9.8±4.3）%、（23.0±6.0）%,顺铂显著诱导HepG2细胞凋亡,且呈剂量依赖性（F=27.890,P＜0.01）.实时荧光定量RT-PCR法检测1.25、2.5、5μg顺铂诱导的HepGR细胞组hZNF23 mRNA相对表达量依次为（10.39±3.08）×10-5、（24.10±2.09）×10-5、（6.90±2.24）×10-4,均显著高于对照组[（9.48±1.80）×10-5,F=6.027,P＜0.01].结论 HCC组织中hZNF23相对表达水平与Edmondson分级密切关联;顺铂对HepG2细胞的凋亡作用可能与hZNF23上调有关.

链球菌溶血素O的体外精子毒性研究

目的：探讨链球菌溶血素O（streptolysin O,SLO）的体外精子毒性。方法：颈椎脱臼处死10~12周龄ICR雄性小鼠,取尾部附睾精子,将精子浓度调整到1×106/ml,并分成2份。一份与终浓度为0.2 U/ml SLO孵育15 min后作为实验组,一份不加SLO作为对照组。测定精子的运动参数以及获能后具有超激活运动状态的精子比例,并进行碘化丙啶（PI）染色和体外受精实验。结果：精子的运动参数实验组与对照组之间差异无统计学意义（P〉0.05）,实验组小鼠精子获能后的超激活现象不明显,精子本身无法恢复膜的阻隔功能,精子体外授精能力大幅下降,与对照组比,差异均有统计学意义（P〈0.05）。结论：SLO不影响精子的运动参数,但是会影响精子的超激活运动,进而大幅度降低精子的体外受精能力。